РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ, МОДЕЛЮВАННЯ ГІПЕРГОМОЦИСТЕЇНЕМІЇ
Біохімічна частина роботи виконана в науково-дослідній клініко-діагностичній лабораторії ВНМУ ім. М.І. Пирогова, - зав. проф. О.О. Пентюк (АТЕСТАТ АКРЕДИТАЦІЇ вимірювальної лабораторії, серія КДЛ, №002087, дата реєстрації 20 жовтня 2004 р., дійсний до 20 жовтня 2009 р.). Морфологічні дослідження виконані за консультації завідувача кафедри гістології та ембріології ВНМУ ім. М.І. Пирогова проф. М.С. Пушкаря та зав. відділом морфології ІФТ, ст.наук. співробітника О.В. Сергієнко.
2.1. Тварини та дієти
В більшості експериментальних робіт, присвячених проблемі ГГЦ, використані в якості лабораторних тварин білі щури-самці, миші [Werstuck et al., 2001; Dimitrova K. et al., 2002], в поодиноких дослідженнях - інші тварини. Тому наші експерименти також проведені на білих щурах-самцях, причому використані дорослі тварини з масою тіла 200±30 г. Експерименти проводили на статевозрілих білих щурах, отриманих з віварію ВНМУ ім. М.І.Пирогова, частково - з віварію інституту фізіології АМН України. Утримання тварин відповідало санітарним вимогам по влаштуванню та обладнанню експериментально-біологічних клінік (віваріїв), затвердженим (МЗ СССР 06.07.1973). Тварин годували натуральними і брикетованими кормами у відповідності до нормативів, затверджених наказом (МЗ СССР №755 от 12.08.77 г). Перед дослідами тварини знаходились на карантині у відокремлених приміщеннях віварію протягом 14 діб. В цей час вони отримували повноцінну стандартну напівсинтетичну крохмально-казеїнову дієту з метою адаптації до цієї дієти. Експериментальні групи тварин формували шляхом випадкової вибірки з урахуванням маси тіла у якості визначального показника. При виконанні експериментів щоденно спостерігали за загальним станом тварин, вживанням їжі та води; один раз на 3-4 доби визначали масу тіла.
Дослідження проводились згідно з Наказом МОЗ України від 01.11.2001 р. щодо порядку проведення доклінічного вивчення лікарських засобів та Методичних рекомендацій [Доклінічні дослідження лікарських засобів (під ред. О.В.Стефанова) - 2001]. Через визначені умовами експерименту проміжки часу тварин контрольної та дослідних груп піддавали евтаназії методом декапітації згідно методичним рекомендаціям (Эвтаназия экспериментальных животных, Москва, 1985).
В зв'язку з тим, що в запланованих нами експериментах проходили випробовування ВМК та препарати порівняння, що містять в своєму складі харчові речовини - вітаміни та мікроелементи - для годування тварин використані стандартні дієти, що дозволяють суворо контролювати харчовий статус піддослідних тварин по всім нутрієнтам, у тому числі вітамінам та мінеральним солям.
В якості основної стандартної дієти взята найбільш поширена напівсинтетична крохмально-казеїнова дієта. Склад та методика її приготування наведені в офіційних документах, довідникових посібниках та оригінальних наукових працях [Инструкция, 1952; Экспериментальная витаминология, 1979; Западнюк и соавт., 1983; Yamada K. et al., 2000]. Вміст інгредієнтів в дієті варіюють в залежності від поставленого завдання. Склад застосованої нами дієти (основної дієти, ОД, дієта №1) наведено на рис. 2.1.
Рис. 2.1. Склад основної дієти (ОД, дієта №1)
Суміш солей у відповідності до сучасних вимог [Yamada K., et al., 2000] була доповнена натрію селенітом, її склад наведено в таблиці 2.1. Треба зауважити, що фізіологічні дози мінеральних солей, рекомендовані різними дослідниками для щурів, близькі між собою.
Таблиця 2.1.
Склад суміші мінеральних солей
ІнгредієнтиКількість, г Натрію хлорид (NaCl)58, 5 Калій фосфорнокислий однозаміщений (KH2PO4)163, 3 Магнію сульфат (MgSO4)24, 1 Кальцій вуглекислий (СаСО3)160, 2 Залізо сірчанокисле (FeSO4 ? 7H2O)11, 1 Калію йодид (KI)0, 322 Сірчанокислий марганець (MnSO4 ? 2H2O)1,87 Сірчанокислий цинк (ZnSO4 ? 7H2O)0, 23 Сірчанокисла мідь (CuSO4 ? 5H2O)0, 2 Хлористий кобальт (CoCl2 ? 6H2O)0, 01 Фтористий натрій (Na F)0, 21 Каплун (K2SO4 Al2[SO4]3 ? 24H2O)0, 047 Калій-хром-сульфат (KCr [SO4]2 ? 12H2O)0, 55 Натрію селеніт (Na2Se)0, 01 Всього:420, 639
Щодо вітамінів то лише вітамін В12 (кобаламін) використовується майже всіма дослідниками в однаковій дозі - 0,03 мг/кг сухої дієти, в той час як інші вітаміни рекомендують в дозах, що значно відрізняються між собою [Экспериментальная витаминология, 1979]. Нами в основну дієту (ОД) вітаміни вносили в таких кількостях: піридоксин - 1,0; фолієва кислота - 0,2; кобаламін - 0,03; тіамін - 4,0; рибофлавін - 5,0; пантотенат - 15,0; нікотинат- 15,0; біотин - 0,2; холін - 50,0; токоферол 150,0; вітамін К (філохінон) - 2,0; ретинол - 1,0; кальціферол - 0,03 мг/кг корму.
Приклад приготування суміші водорозчинних вітамінів для ОД (суміш вітамінів №1). В фарфорову ступку вносять наважки кожного з вказаних вітамінів в 10-разовій дозі, наприклад, 10 мг піридоксину, 2 мг фолату і т.д. Далі в ступку вносять глюкозу або сахарозу в кількості до 50 г, тобто загальна вага суміші доводиться до 50 г. Суміш ретельно перемішується, переноситься в герметичний скляний посуд та зберігається в холодильнику. В процесі приготування ОД до неї вносять наважку суміші вітамінів №1 в кількості 5 г на 1 кг корму (тобто по 500 мг на кожні 100 г сухого корму). Крім основної дієти використовували також інші дієти (таблиця 2.2).
Таблиця 2.2
Порівняльний склад дієт № 1, 2 та 3
Інгредієнти№ та склад дієт в %№1№2№3Казеїн, відмитий від водорозчинних вітамінів18,018,017,0Жир, збагачений жиророзчинними вітамінами10,010,010,0Целюлоза2,02,02,0Суміш мінеральних солей3,53,53,5Суміш всіх водорозчинних вітамінів з глюкозою0,50,5-Суміш водорозчинних вітамінів (без вітамінів В6, В9 та В12) з глюкозою--0,5Фталазол--1,0L-метіонін-1,01,0Крохмаль, відмитий від вітамінівдо 100до 100до 100 Так, для отримання моделі хронічної метіонінової ГГЦ використовували дієту №2. Фактично це ОД, збагачена 1 % L-м
- Київ+380960830922