РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Исследования проводили на клетках костного мозга половозрелых собак (самцов 3-4
лет). Количество животных в работе 40. Животные были здоровы, вакцинированы.
Для решения поставленных задач применялись экспресс-методы оценки состояния ККМ
с помощью суправитального окрашивания трипановым синим, азур II-эозином по
методу Романовского-Гимза; цитохимические методы выявления гликогена и
мембранных фосфолипидов. А также ферментативные методы определения АТФ, Г-6-Ф,
ПВК, лактата.
Использованные в работе реактивы фирм “SIGMA”, “MERСK”, “ПанЭко”, “Реагент”,
“Биолот” имели марки «ОСЧ», «ЧДА».
2.1. Выделение клеток костного мозга
КМ получали из бедренных костей анестезированных животных методом
костномозговой пункции с вымыванием средой 199 [162, 163]. Клетки 3-х кратно
пропускали через иглы с уменьшающимся диаметром. Концентрацию клеток в
суспензии доводили до 1Ч107/мл путем разведения рабочей средой [18, 33].
Рабочая среда: 3% - сыворотка крови эмбриональная телячья; 91% - среда 199; 6%
- раствор цитрата натрия 5 %-ый.
2.2. Обработка костного мозга криопротекторами и замораживание-отогрев
В работе использовали растворы криопротекторов, предоставленных сотрудниками
отдела криопротекторов ИПКиК НАН Украины.
Костный мозг собак криоконсервировали на рабочей среде под защитой
криопротекторов в следующих конечных концентрациях: диметилсульфоксид (ДМСО) –
5, 7, 10%; полиэтиленоксид с М. м. 400 (ПЭО-400) – 10, 15, 20%; глицерин – 10,
20, 30%. Время экспозиции КМ с ДМСО составляло 10 мин, с глицерином и ПЭО-400 –
30 мин при температуре +4 0С [11, 44].
Замораживание КМ проводили в стандартных пластиковых контейнерах объемом 1,5 мл
(«ЕРРЕNDORF», SРЕКТАR) по двухэтапной программе: на первом этапе проводили
охлаждение со скоростью 2-3 оС/мин до - 80 оС, на втором этапе - быстрое
погружение в жидкий азот [18, 52, 85, 144, 155, 227, 228]. Отогрев образцов
осуществляли на водяной бане при температуре +41 °С постоянно покачивая
контейнер с пробой.
Маточные растворы криопротекторов готовили на 0,9%-ом NаСl, приготовленном на
10 мМ фосфатном буфере, рН 7,4. Конечная концентрация ДМСО при добавлении к
суспензии ККМ составляла 5% (0,64 М), 7% (0,9 М), 10% (1,28 М); ПЭО-400 - 10%
(0,25 М), 15% (0,5 М), 20% (0,63 М), глицерин - 10% (1,1 М), 20% (2,1М), 30%
(3,2 М).
2.3. Удаление криопротектора из клеток
Криопротектор из удаляли после отогрева КМ путем медленного двукратного
разбавления рабочей средой с последующим центрифугированием (центрифуга
охлаждающая К-24, Германия) 10 мин при 90g (800 об./мин). Надосадок удаляли, а
осадок ресуспензировали с добавлением 1 мл эмбриональной телячьей сыворотки
[33].
2.4. Морфологические исследования
Для оценки влияния факторов криоконсервирования на сохранность КМ собак были
использованы методы: подсчет ядросодержащих клеток в камере Горяева,
суправитальное окрашивание раствором трипанового синего, оценка миелограммы.
Исследования проводили методом световой микроскопии на микроскопах Biolux
(Германия) и К. ZEISS (Германия) с фотографической регистрацией изображения.
2.4.1. Подсчет ядросодержащих клеток костного мозга
в камере Горяева [2]
В меланжер для лейкоцитов набирали суспензию КМ с 1% раствором уксусной кислоты
с метиленовым синим. Подсчитывали клетки под увеличением (обьектив - Ч40,
окуляр - Ч10) в 25 больших квадратах на двух сетках. Среднеарифметический
результат вычисляли по формуле:
Х= (2.1)
где Х – количество ядросодержащих клеток КМ в 1мм3;
а – сумма форменных элементов, сосчитанных в объеме камеры;
б – количество квадратов;
в – разведение клеток;
4000 – объем малого квадрата 1/4000 мм3.
2.4.2. Суправитальное окрашивание клеток костного мозга трипановым синим [51,
52, 205]
На предметном стекле смешивали равные по объему капли взвеси КМ и 0,1%-го
раствора красителя трипанового синего. Через 0,5 мин каплю накрывали покровным
стеклом и изучали в световом микроскопе (обьектив - Ч40, окуляр - Ч10) по полям
зрения на 100 клеток, не более 2 мин. Поврежденные клетки окрашиваются в синий
цвет, жизнеспособные клетки остаются неокрашенными. Количество окрашенных и
неокрашенных клеток выражали в процентах. Сравнивая этот показатель с исходным
количеством клеток в суспензии, посчитанным в камере Горяева, вычисляли число
клеток сохранившихся после замораживания.
2.4.3. Оценка миелограммы
Для морфологической оценки клеток использовали общепринятую классификацию,
приведенную в [56, 73]. Анализ миелограмм проводили на мазках, приготовленных
из суспензии КМ окрашенных азур II - эозином по методу Романовского-Гимза [6].
В световом микроскопе (обьектив - Ч100, окуляр - Ч10) под масляной иммерсией
оценивали качественный состав миелограммы. Данные выражали в процентах.
2.5. Цитохимические исследования
Цитохимические исследования проводили на мазках КМ. В световом микроскопе
(обьектив - Ч100, окуляр - Ч10) подсчитывали по 100 элементов каждой группы
клеток и в каждой из клеток определяли степень интенсивности окраски.
Отсутствие окраски принимали за нулевую степень (0). Наличие в цитоплазме
единичных гранул продукта реакции (до 30), принимали за интенсивность реакции
1-й степени (+). При 2-й степени (+ +), гранулы заполняли почти всю цитоплазму
(до 60). При 3-й степени гранулы (более 60) заполняли всю цитоплазму, не
оставляя в ней неокрашенных участков.
При вычислении, клетки с нулевой интенсивностью исключали. Показатели
интенсивности реакции выражали с помощью СГК (среднего гистохимического
коэффициента). СГК для каждой группы клеток вычисляется по формуле:
СКГ= (2.2)
где, цифры
- Київ+380960830922