РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Штами бактерій і бактеріофаги
В роботі були використані наступні штами бактерій:
Вид
№ в колекції
№ лабораторний
Erwinia spp
194-8
89
167-1
87
128-3
88
78-3
86
59-2
85
48-1
84
45-2
83
4[2]
81
E. carotovora
subsp. сarotovora
Б1
37
4A
36
5A
71
14А
72
24А
73
25А
74
31А
17
33А
16
35А
12
40А
75
46А
76
48А
25
49А
77
50А
32
52А
35
53А
54А
41
59А
55
60А
78
61А
27
64А
10
66А
18
69А
54
70А
15
71А
79
J13
20
J15
80
g48
М2-8
82
А також: Есс 153 (29), ZM1 (40); E. carotovora subsp. atroseptica g217 (57)
Спонтанні дисоціанти: 40i1 (ZM1), J2/S2 (J2 [44]), 62A-d (62A(5)), M2-4/50RI
(Ecc M2-4);
Трансдуктанти: RC5297/lys33/1-Tdu5 (pKM101); RC5297/ Tco-1 (pKM101);
RC5297/Tdu3, 48A-7/4b (pCa25:Tn9), J2-5 (pKM101), 66A/18;
Штами E. coli: K12, BE, CR63, 112, gA120, TG-1, AB257, J53, C600, C600 str,
HB101, DH1, L1+;
Штами Pantoea agglomerans: Bg1, G150, 9/7, 28/2;
Фаги: ZF40, ZF40c6, ZF40/421, P1, T4, T5, T7.
Штами були отримані з музею відділу молекулярної генетики бактеріофагів, ІМВ
НАН України. Лабораторні номери (вказані в дужках) колекції Ф.І. Товкача.
2.2. Поживні середовища, буферні розчини та хімічні реактиви
Для вирощування бактерій використовували рідкі та агаризовані поживні
середовища. Агаризовані середовища містили 1,4% агар-агару, напіврідкі поживні
середовища для титрування фагів – 0,5% агар-агару. На основі сольових
компонентів середовища А (А-буфер) були приготовлені похідні, які містили різні
елементарні сахари або пектин:
1) AG – буфер А з додаванням глюкози (0,2%);
2) AL - буфер А з додаванням лактози (0,2%)
3) AM - буфер А з додаванням мальтози (0,2%);
4) AP - буфер А з додаванням пектину (1,0%).
1. Середовище LB, г/л: триптон – 10, дріжджовий екстракт – 5, NaCl – 10 [84].
Середовище використовували для титрування і вирощування бактеріальних клітин,
титрування бактеріофагів, отримання фаголізатів, та проведення експериментів по
трансдукції.
2. Мінімальне середовище А, г/л: КН2РО4 – 10,5; К2НРО4 – 4,5; (NH4)2SO4 – 1,0;
натрію цитрат – 0,5. Після стерилізації додавали 1мл 1М розчину MgSO4 Ч7H2O та
джерело вуглецю (глюкоза або лактоза) в концентрації 0,2% [84]. Середовище
використовували для титрування фагів та одержання фаголізатів. Для титрування
бактерій використовували мінімальне середовище А без додавання Mg2+ і джерела
вуглецю.
3. Мінімальне середовище М9, г/л: Na2HPO4 – 6; КН2РО4 – 3; NH4Cl – 1, NaCl –
0,5; Після його стерилізації додавали 1мл 1 М розчину MgSO4Ч7H2O. Як джерело
вуглецю використовували глюкозу, або лактозу в кінцевій концентрації 0,2% -
0,8%. [84]. Середовище використовували для вирощування бактерій та
бактеріофагів. Розведення суспензій клітин та фагових лізатів для їх титрування
проводили в мінімальному середовищі М9 без додавання джерела вуглецю.
4. Напіврідкий (верхній) агар, готували на основі середовища LB з додаванням
0,5 % агару, використовували при титруванні бактеріофагів.
Хімічні реактиви. В роботі використовувались хімічні реактиви вітчизняного
виробництва і виробництва фірми „Sigma” і „Serva”.
В роботі використовували ендонуклеази рестрикції фірми „СибЭнзайм” (Росія).
Ферменти зберігали при температурі – 20 °С.
Застосовували ендонуклеази рестрикції: HindIII, BglII, PstI та BamHI.
Стоп-буфер для рестрикії (Ч5): Na2ЕДТА – 0,1 мМ, бромфеноловий синій – 0,2 %,
фікол – 7%, [85].
Буфер РВ для виділення фагової ДНК: NaCl – 50 мМ; тріс-HCl – 50 мМ.
Тріс-фосфатний буфер для електрофоретичного розділення капсидних фагових
структур, фагової ДНК та рестрикційних фрагментів, г/л: тріс-HCl – 87; NaH2PO4
– 94; Na2ЕДТА – 7,44 [85].
Буфер Е для виділення та електрофоретичного розділення плазмідної ДНК:
тріс-ацетат (рН 7,9) – 40 мМ; Na2ЕДТА – 2 мМ [86].
Лізуючий буфер для виділення плазмідної ДНК: тріс-HCl – 50 мМ; SDS – 3 %; 2 M
NaOH до рН 12,6 [86]. Буфер зберігали при кімнатній температурі не більше 7
діб.
Буфери для зберігання фаголізатів: 1) STMG: NaCl – 200 мМ; тріс–HCl (рН 7,4) –
10 мМ; MgCl2 – 10 мМ; желатина – 100 мкг/мл [87].
2) STMF: NaCl – 200 мМ; тріс–HCl (рН 7,5) – 10 мМ; MgCl2 – 10 мМ; фікол – 4%
[87 ].
Всі буфери зберігали при 4 °С.
2.3. Методи досліджень
В роботі використовували адекватні вірусологічні, мікробіологічні,
молекулярно-біологічні, біохімічні та генетичні методи досліджень.
2.3.1. Проведення лізогенної індукції дефектних профагів E. carotovora subsp.
carotovora
На чашки з середовищем LB висівали експрементальні штами, та вирощували 24 год
при 28 ?С. Відбирали одну колонію, яка виросла на чашці, та ставили на
подальший ріст у рідкому середовищі при аерації на 18 год, 28?С. Далі розводили
у 100 разів у мінімальному середовищі А, та підрощували 3 години до досягнення
культурою стаціонарної фази росту. Лізогенну індукцію здійснювали в середовищі
АL або AG за наступною схемою. Нічну культуру Есс підрощували при активній
аерації до експоненційної фази росту клітин і додавали налідиксову кислоту до
кінцевої концентрації 20 мкг/мл. Продовжували інкубування іще протягом 1 год,
після цього культуру залишали лізувати при кімнатній температурі на 18 годин,
без аерації. Отримані лізати осаджували впродовж години при 5000 об/хв при 4?С.
Супернатант центрифугували знову при 25000 об/хв, 3 год при 10?С. Отриманий
осад ресупендували у 500 мкл буфера STMG або STMF. Одержану суспензію звільняли
від залишків клітин шляхом їх осадження на мікроцентрифузі ELMI при 11000 об/хв
протягом 5 хв. Така ж схема була застосована для лізогенної індукції за
допомогою мітоміцину С [88].
2.3.2. Дослідження динаміки лізогенної