розділ 2) розсівали до окремих колоній на LB?агарі. Похідні 10-и індивідуальних клонів було перевірено на стійкість до різних концентрацій олеандоміцину (Оm). В результаті досліджень було встановлено, що 6 із 10 клонів ЕАТ 39А є високостійкими до олеандоміцину (приблизно 250 мкг/диск); 4 інших клони були Oms і гинули при концентрації антибіотика меншій, ніж 1,5 мкг/диск.
Для встановлення особливостей росту батьківського штаму і похідних від нього клонів Oms були використані LB? і АП?агар. При цьому було знайдено незначні розходження в часі появи колоній і їхньому розмірі при 25?С, які нівелювалися після 1 доби росту. Швидкість росту Oms?дисоціантів була істотно меншою, ніж батьківського штама на МС?агарі. Розвиток забарвлення (темно-червоне) у випадку дисоціантів відбувався також повільно; остаточне формування колоній спостерігалося на 4 ? 5 добу, тоді як забарвлені колонії вихідного штама ЕАТ 39А з'являлися на третю добу. Найбільш помітне розходження між колоніями дикого типу і Oms?варіантів спостерігалося на лактозному диференціальному середовищі ЕМВ, на якому варіанти, чутливі до олеандоміцину, утворювали дуже дрібні колонії, які набували типового забарвлення на 5 ? 6 добу (рис.6.2.1). Порівняльне вивчення колоній E.coli К12
Рис.6.2.1. Ріст і забарвлення колоній батьківського штама Erwinia carotovora subsp. atroseptica 39А (1) і його Рое?дисоціанта 331 (2) на ЕМВ?агарі. Колонії отримані на одній чашці після 5-ти добового вирощування.
(Lac+), E.coli С600 (Lac?), ЕАТ 39А (Lac+) і ЕАТ 39А Oms на ЕМВ дозволило встановити, що Oms?варіанти нормально зброджують лактозу і не можуть розглядатися як Lac?-мутанти. Фенотип для дрібних колоній дисоціантів, отриманих на ЕМВ?агарі, було позначено як Poe (for pepit on EMB-agar).
Наступний аналіз показав, що у випадку музею № 1 (див. пункт 2.3.5) біля 18% клонів E. carotovora subsp. atroseptica 39А мають фенотип Poe, тоді як для анологічних зразків, що зберігаються при 4 ?С (музеї № 3 і № 4), утворення Poe?клонів не характерне. В музеї № 2 (зберігання під вазеліновою олією при кімнатній температурі) Poe?клітини зустрічаються з частотою біля 2%. Ми проаналізували 50 колоній ЕАТ 39А цього незвичного фенотипу (музей № 1) на стійкість до олеандоміцину і встановили, що приблизно 2/3 від загальної кількості Poe?варіантів характеризуються низькою стійкістю до даного антибіотика ? в 180 разів меншою в порівнянні з батьківським штамом.
Подвійні фенотипові варіанти PoеOms, а також PoеOmr, поряд із вихідним штамом ЕАТ 39А (Poе?Omr), було перевірено на чутливість до деяких макромолекулярних каротоворицинів і власних коліцинподібних каротоворицинів, а також на кілерну активність коліфагів Т2 і Т4. Всі клони PoеOms і PoеOmr за зазначеними характеристиками не відрізнялися від ЕАТ 39А, за винятком дії власного ССТV батьківського штаму. Тоді як вихідний штам ЕАТ 39А і фенотипові варіанти PoеOmr були стійкими до дії ССТV 39А, всі без винятку клони PoеOms піддавалися кілерній дії цього бактеріоцина. Таким чином, крім характерного росту на лактозних середовищах і підвищеній чутливості до олеандоміцину, незвичні музейні дисоціанти мають ще одну фенотипову ознаку ? чутливість до ССТV, утвореному батьківським штамом при лізогенній індукції (фенотип Bns). Далі виявилося, що мітоміцин?індуковані лізати клітин PoеOmsBns здатні утворювати інший вид невеликих каротоворицинів, які не вбивають штам ЕАТ 39А, але вбивають штами?продуценти ? (PoeOmsBns). Вперше у незвичних фенотипічних варіантів виявлено наявність автоцинів, які порушують правило імунної відповіді. Для даного фенотипу ми запропонували назву Аu (autocin).
Остаточна перевірка на антибіотикостійкість (олеандоміцин, еритроміцин, ампіцилін, пеніцилін і карбеніцилін) показала, що клітинам PoeOmsBnsAu характерна також підвищена чутливість до іншого макролідного антибіотика ? еритроміцина (8-ми кратне зниження чутливості у порівнянні з ЕАТ 39А).
Таким чином, вивчення гетерогенності популяції E. carotovora subsp. atroseptica 39А, що виникає при тривалому зберіганні клітин при кімнатній температурі, показало наявність двох типів дисоціантів ? Poe і PoeOmsErsBnsAu. Для зручності другий тип дисоціантів цього штама було позначено через PoeMph (Mph ? множинний фенотип).
Для вивчення загальних закономірностей популяційної гетерогенності було перевірено музейні зразки № 1 трьох інших штамів ЕАТ і п'ятьох штамів ЕСА. Було встановлено, що всі досліджувані штами ЕАТ характеризуються дуже високим рівнем Poe?варіантів. Їхнє число складає від 18% (ЕАТ 39А) до 94 % (ЕАТ g217). Як випливає із результатів, поданих у табл.6.2.1, на відміну від штама 39А, три інших штами підвиду atroseptica утворюють тільки один тип дисоціантів, які не асоційовані зі зміною стійкості до антибіотиків. Незначні варіації в чутливості до ампіциліну в деяких Poe?варіантів ЕАТ g125 (табл. 6.2.1) не можуть бути пов'язані з істотною зміною фенотипу.
Poe?варіанти штамів ЕАТ 36, g125 і g217 не змінюють характеру сприйнятливості до МСТV і коліфагів, а також до власних ССТV (табл.6.1.1). У них на відміну від дисоціантів другого типу штама ЕАТ 39А (PoeMph) не спостерігається множинної зміни фенотипу. Проте Poe?фенотип цих штамів, як і аналогічний штама ЕАТ 39А, є їхньою стабільною характеристикою і не змінюється в процесі частих клонувань.
Перевірка штамів ЕСА, відібраних із усіх музейних варіантів (№ 1?4), показала, що представники цього підвиду пектолітичних ервіній не утворюють з помітною частотою Poe?дисоціантів при зберіганні (штами ЕСА: J2, 66A, 13A, 62A і Ec153). Забарвлення окремих колоній цих бактерій на ЕМВ? і МС?агарі розвивалося нормально протягом 2 ? 3 діб при температурі 25 ?С, а характерний колір колоній був навіть більш вираженим, ніж у випадку контрольних колоній Lac+ штама E.coli K12.
Припускаючи, що поява Рое?фенотипу в ЕАТ може обумовлюватися різкими коливаннями навколишньої темпер