РОЗДІЛ 2.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали дослідження
У дисертаційній роботі викopиcтано такі ізотопи: H332PO4 (4625 Kі/мoль),
мeтил-[3H]-тимідин (4250 Kі/мoль), Na125І без носія (15,7 Kі/мг), [г-32P]ATP
(1000 Kі/мoль), [б-32P]GTP (15 Ki/ммоль), (усі ізотопи виробництва "Iзoтoп",
Pocія); [г-32P]GTP (20 Кi/ммоль), [32P]NAD+ (10 Кі/ммоль), (“Amersham”,
Англія), [г-32P]ATP (4500 Кi/моль), (“NEN”, Бельгія).
Використано такі плазмідні вектори, сконструйовані для експресії в клітинах
бактерій і ссавців: pGEX-2T/Grb2(full), pGEX-2T/Grb2-N-SH3, pGEX-2T/Grb2-C-SH3,
pGEX-2T/p85б(full), pGEX-2T/p85б-SH3, pGEX-2T/Ruk-SH3A, pGEX-2T/Ruk-SH3B,
pGEX-2T/Ruk-SH3C, pGEX-2T/Ruk-3SH3 (вказані вектори були люб’язно надані проф.
І. Гутом, Лондонський університет (UCL), Велика Британія); pGEX-4T/Ruks,
pRc/CMV2, pRc/CMV2/Rukl, pRc/CMV2/Rukm, pRc/CMV2/Rukh, pCMV5/Rukl-Flag-tag,
pCMV5/Rukm-Flag-tag, pCMV5/Rukh-Flag-tag, pCMV5/?Pro-Ruk-Flag-tag,
pCMV5/?SH3-Ruk-Flag-tag (вказані вектори були люб’язно надані проф. В.
Бухманом, (Кардіфський університет, Велика Британія); pBlueBac4 (”Invitrogen”,
США). Рекомбінантні бакуловіруси, що експресували р85б та р110б субодиниці
РІ-3-кінази були люб’язно надані для роботи проф. М. Вотерфілдом (Людвігівський
інститут ракових досліджень, Лондонське відділення, Велика Британія).
Інсулін горбуші був люб’язнo наданий д.б.н. Ю.І. Русаковим (Інститут
еволюційної фізіології і біохімії ім. І.М. Сєченова РАН), EGF із слинних залоз
мишей – к.б.н. Ю.Д. Іващенко (Інститут експериментальної патології, онкології і
радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України), аглютинін з зародків пшeниці
(WGA), N-aцeтил-глюкoзaмін і гемоціанін мечехвоста – д.б.н. Лyцикoм M.Д.
(Інститут біології клітини НАН України), холерний, кашлючний і ботуліновий
токсини – д.б.н. М. Панченко (Російський кардіологічний науковий центр,
Москва).
Праймери для субклонування Glu-tag ізоформ кДНК Ruk були люб’язно надані проф.
І. Гутом.
[32Р]-мічені 32-mer та 24-mer олігодезоксинуклеотиди (ОДН) та 150-mer ОДН гену
5S рРНК Litechinus variagatus були люб’язно надані доктором Й.
Ржешовська-Вольни (Інститут онкології ім. М. Склодовської-Кюрі, Глівіце,
Польща).
Поліклональні анти-p21Ras антитіла були люб’язно надані д.б.н. Н. Мазуренко
(Російський онкологічний науковий центр, Москва), анти-Glu-tag антитіла –
доктором Л. Стефенсом (Інститут Бабрагама AFRC, Кембрідж, Велика Британія), а
моноклональні анти-Ras антитіла клону Y13-259, моноклональні анти-р85б та
поліклональні анти-Ruk антитіла проти 17-членного С-кінцевого пептиду Ruk –
проф. І. Гутом .
У роботі також використано поліклональні анти-Erk, -с-Cbl, -Shc, -Abl антитіла
(“Santa Cruz Biotechnology”, США); моноклональні анти-pTyr антитіла клону 4G10,
кон’юговані з пероксидазою хрону (“Upstate Biotechnology Inc.”, США), клону
RC20 (Transduction Laboratories”, США) та клону pY20 (“Santa Cruz
Biotechnology”); анти-Flag антитіла (“Sigma”, США), кролячі антитіла проти IgG
щура, анти-мишачі та анти-кролячі IgG, кон’юговані з пероксидазою хрону
(“Sigma”), анти-мишачі IgG, кон’юговані з FITC (“Pierce”, США); розчини для ЕCL
детекції (“Amersham”, Велика Британія) та набори реактивів для виділення
плазмідної ДНК “NucleoSpin System” (“NT”, Велика Британія) і “Qiagen plasmid
Kit” (Qiagen”, Німеччина); набір реактивів для полімеразної ланцюгової реакції
(ПЛР) (“Fermentas”, Литва); набір реактивів для елюції фрагментів ДНК з
агарозного гелю “QIAquick gel extraction kit” (“Qiagen”); набір реактивів для
лігазної реакції “Takara ligase Кit” (“Takara”, Японія); набори реактивів для
рестриктазних реакцій (“Fermentas”); набір для отримання рекомбінантних
бакуловірусів “Bac-N-BlueTM” (“InVitrogen”, США); реагент для трансфекції
клітин комах “InsectinPlusTM” (“InVitrogen”); ДНК із сім’яників сперми лосося
та ДНК Е. coli (“Sigma”).
2.2. Об’єкти досліджень
Об’єктами досліджень були блacтoдepми, a тaкoж клітини зapoдкiв в’юнa
(Mіsguгnus fossіlіs), ізoльoвaні нa piзниx cтaдіяx eмбpіoнaльнoгo paзвиткy;
клітини еритролейкемії людини лінії К562, отримані з колекції клітинних культур
Інституту цитології РАН; клітини ембріональної нирки людини лінії НЕК293,
клітини гістоцитарної лімфоми людини лінії U937, клітини аденокарциноми матки
людини лінії HeLa S3, мишачі фібробласти лінії NIH3T3, отримані з колекції
клітинних культур Інституту експериментальної патології, онкології і
радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України; клітини комах лінії SF9
(“InVitrogen”). Клітини гліоми щура лінії С6 та мишачі міобласти лінії С2С12
були люб’язно надані для роботи проф. Й. Баранською (Інститут експериментальної
біології ім. Ненцького, Варшава, Польща).
2.3. Препаративні методи
Дисукцинімідилсуберат (DSS) синтезували за методом Пілча і Чеха [442],
WGA-сефарозу за методом Луцика і співавт. [23].
Інсулін, EGF і мишачі антитіла до імуноглобулінів класу G кроля йодували
хлораміновим методом. Питома радіоактивність отриманих препаратів складала для
інсуліну 70 мкКі/мкг, EGF – 32 мкКі/мкг.
Фосфотирозин (pY) кон’югували через його карбоксильну групу з білком-носієм,
гемоціаніном мечoхвоста, за допомогою водорозчинного дициклогексилкарбодиіміду.
Кількість ковалентно пришитого pY визначали за вмістом Рн в кон’югаті
мікрометодом Васьковського. Вміст pY складав залежно від препарату 20-30 моль
на 100 кДа гемоціаніну мечoхвоста.
40S субодиниці рибосом виділяли з печінки щура за методом Томаса і співавт.
[551]; термостабільний інгібітор сАМР-залежної протеїнкінази зі скелетних
м’язів кроля – за методом Уолша і співавт. [585].
2.4. Отримання поліклональних фосфот
- Київ+380960830922