Модели динамики полиэлектролитов в процессах электрокинетического фракционирования

2
ОГЛАВЛЕНИЕ
Список сокращений.....................................................5
Введение.........................................:....................6
т
1 Дисперсия электрокинетической подвижности и импульсный гель-электрофорез полиэлектролитов........................!...............18
1.1 Введение.........................................................18
1.2 Дисперсия электрокинетической подвижности полиэлектролитов 27
1.2.1 Диффузионная теория рептаций...................................27
1.2.2 Дисперсионная модель динамики полиэлектролита в импульсном
поле.................................................................30
1.3 Расчеты импульсного гель-электрофореза ДНК.......................38
1.3.1 Одномерный инверсионный гель-электрофорез......................38
1.3.2 Двумерный импульсный гель-электрофорез.........................40
1.4 Численное моделирование динамики полиэлектролитов на основе диффузионной теории рептаций..............................................46
1.5 Неидеальный одномерный газ рептонов..............................52
1.6 Выводы...........................................................59
2 «Гидродинамическая» теория движения полимерной цепи в сильном внешнем поле.............................................................60
2.1 Введение.........................................................60
2.2 Статистическая механика отрезка полимерной цепи в геле...........64
2.2.1 Свободно-сочлененная полимерная цепь...........................64
2.2.2 Уравнение состояния блоба - отрезка полимерной цепи в поре геля ....68
2.2.3 Статистическая механика концов полимерной цепи во внешнем поле..75
2.3 Уравнения одномерной «гидродинамики» полимерной цепи.............79
2.3.1 Одномерная «гидродинамика» полимерной цепи.....................79
2.3.2 Формула де Жена................................................81
№
2.4 Численное моделирование «гидродинамики» полимерной цепи в импульсном поле........................................................83
2.4.1 Дискретная модель «одномерной гидродинамики»...................83
3
2.4.2 Ветвления полимерной цепи в геле..................................86
2.5 Результаты расчетов динамики полимерной цепи в импульсных полях ..91
2.6 Выводы.............................................................101
3 Модели процессов электрокинетического фокусирования полиэлектролитов .................................................................. 102
3.1 Введение...........................................................102
3.2 Точное решение нестационарной задачи электрокинетического фокусирования полиэлектролитов.................................................107
3.3 Устойчивость стационарных распределений ионов в электрических полях ...................................................................115
3.3.1 Уравнения Нернста-Планка и аналогия с гидродинамикой.............115
3.3.2 Буферная система из двух сортов ионов - амбиполярная диффузия ...117
3.3.3 Устойчивость буферной системы с тремя сортам ионов...............119
3.3.4 Неустойчивость стационарных распределений ионов в многокомпонентных буферных системах..............................................122
3.4 Фокусирование макромолекул в неоднородных электрических полях ..124
3.5 Моделирование неоднородных электрических полей методом граничных элементов..............................................................130
3.5.1 Метод угловых интегралов.........................................130
3.5.2 Расчет неоднородных электрических полей методом граничных элементов ................................................................136
3.6 Выводы.............................................................142
4 Нелинейные процессы фракционирования и фокусирования.................143
4.1 Введение...........................................................143
4.2 Нелинейный импульсный гель-электрофорез фрагментов ДНК.............148
4.3 Нелинейная фокусировка в неоднородных электрических полях 159
4.4 Методика быстрой сепарации больших фрагментов ДНК..................168
4.5 Нелинейный гель-электрофорез комплексов белков и ионных детергентов ...................................................................177
4
4.5.1 Одномерный нелинейный гель-электрофорез комплексов белков и ионных детергентов.......................................................177
4.5.2 Двумерный гель-электрофорез комплексов белков...................183
* 4.5.3 Нелинейный гель-электрофорез нативных белков....................187
4.6 Выводы............................................................190
5 Двойной заряженный слой и электродная кинетика......................196
5.1 Введение..........................................................191
5.2 Асимптотическая модель двойного заряженного слоя..................196
5.2.1 Двойной заряженный слой.........................................196
5.2.2 Квазинейтральная область........................................201
5.2.3 Вольтамперная характеристика....................................201
5.3 Численное моделирование сложной электродной кинетики..............206
5.3.1 Результаты расчетов вольтамперных характеристик.................206
5.3.2 Учет ионов буферного электролита................................208
5.3.3 Сложная электродная кинетика....................................209
5.4 Макрокинетическая модель тафелевской зависимости..................213
* 5.5 Обратные задачи электродной кинетики..............................219
5.5.1 Постановки обратных задач.......................................219
5.5.2 Методы решения обратных задач...................................220
5.5.3 Нелинейные обратные задачи......................................226
5.5.4 Параметрические обратные задачи.................................228
5.5.5 Обратные задачи электродной кинетики............................230
5.6 Выводы............................................................233
Заключение............................................................234
Приложение: комплекс программ «Laplas»................................237
Литература............................................................246
*
5
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ДСН -додецил сульфат натрия - ионный детергент
ИЭФ - изоэлектрическое фокусирование
КП - комплекс программ
КД - кило-дальтон
МГЭ - метод граничных элементов
НК - наименьших квадратов
НЭФ - нелинейный электрофорез
ОДУ - обыкновенное дифференциальное уравнение
ПААГ- полиакриламидный гель
РНК - рибонуклеиновая кислота
САР - сращиваемых асимптотических разложений (метод)
СЛАУ- система линейных алгебраических уравнений
тпн - тысяч пар нуклеотидов (единица измерения размеров цепи ДНК)
ЭФГ - электрофореграмма
BFP - bacterial fingerprinting - бактериальный «отпечаток пальцев»
CHEF - clamped homogeneous electrophoresis
CFGE - crossed field gel electrophoresis - двумерный импульсный гель-электрофорез
SDS PAGE - sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis FIGE - field inversion gel electrophoresis - одномерный импульсный гель-электрофорез
ZIFE - zero integral field electrophoresis - электрофорез в импульсном поле с нулевым средним.
*
Введение
Электрокинетические методы фракционирования (сепарации) макромолекул полиэлектролитов, в особенности - гель-электрофорез и электрофокусирование, в последние десятилетия испытали стремительный прогресс и развитие и нашли широкое применение в самых современных разделах науки и технологии. В настоящее время и гель-электрофорез, и электрофокусирование, наряду с хроматографией и ценрифугированием, занимают центральное место среди способов фракционирования полиэлектролитов и признаны одними из наиболее мощных инструментов поиска и сепарации макромолекул ДНК, белков и их комплексов, РНК и других биополимеров [1-4]. Высокая разрешающая способность и сравнительная простота исполнения гель-электрофореза и электрофокусирования сделали их незаменимым средством исследования и выделения биологических макромолекул. Всевозрастающий интерес к этой области исследований обусловлен главным образом тем, что электрокинетические процессы фракционирования составляют технологическую базу, основу современной экспериментальной молекулярной биологии. Непрерывный рост числа новых научных журналов и публикаций является показателем активного развития этой области. По данным информационнопоисковой системы “РиЬМесГ [5], к началу 2005 года количество публикаций, содержащих ключевые слова ‘^еГ’ и “е1еЩгор1юге518”, превысило 9000.
Применение гелей для фракционирования макромолекул стало базовой инновацией в электрокинетических технологиях сепарации и позволило преодолеть основную трудность ранних методик электрофореза - конвективную неустойчивость слоя электролита, возникающую при прохождении электрического тока. Именно отсутствие конвективных движений приводит к высокому качеству электрофоретического фракционирования, во многом определяя успех современных электрокинетических методик.
Методики фракционирования полиэлектролитов, основанные на гель-элекгрофорезе. позволили секвенировать (установить последовательность
нуклеотидов ДНК) и «прочесть» генетический текст генома человека и ряда других организмов, и, наряду с методами электрофокусирования, служат главным поставщиком новых биологических макромолекул.
Вместе с тем, несмотря на неоспоримые достижения приложений элек-трокинетического фракционирования, теоретическое обоснование и интерпретация многих современных экспериментальных результатов и практических методик заметно отстают от потребностей практики и делают проблему их изучения особенно важной и актуальной.
В данной работе рассматриваются почти исключительно (импульсный) гель-электрофорез и электрофокусирование в гелях, так как именно эти элек-трокинетические процессы имеют наибольшее практическое значение, как основа наиболее эффективных технологий фракционирования биополимеров и других полиэлектролитов.
Основная задача, возникающая при исследовании физических основ гель-электрофореза и электрофокусирования - это изучение динамики движения заряженной полимерной макромолекулы в геле, под действием внешних электрических полей. Возникающий при этом широкий круг проблем и задач тесно связан с целым комплексом научных направлений физики конденсированного состояния.
Теоретические основы современного гель-электрофореза и электрофокусирования полиэлектролитов включают два основных раздела - теорию электрокинетических процессов и явлений, и статистическую физику полимерных макромолекул. Теоретические основы электрокинетических процессов и двойного заряженного слоя были заложены Х.Л.Ф. Гельмгольцем,
Н. Смолуховским, Ф. Кольраушем, а затем продолжены в работах Б.В. Дерягина и С.С. Духина, В.Г. Левина, X. Рильбе (Свенссона), и других. Современная теоретическая физика полимеров разрабатывалась в работах П. Флори, И.М. Лифшица, С.Ф. Эдвардса, М.В. Волькенштейна, П.Ж. де Жена,
А.Р. Хохлова, успешно применивших в этой области методы теоретической физики. Теоретические основы динамики полимерных макромолекул под
действием внешних полей были заложены в работах В.А. Каргина и Г.Л. Слонимского, П.Е. Рауса, Б. Зимма, П.Ж. Де Жена.
Среди рассматриваемых в работе полиэлектролитов основное внимание уделяется биополимерам - макромолекулам ДИК, РНК и белков, представляющим основной интерес для молекулярной биологии и биотехнологии. Двойная спираль ДНК представляет собой едва ли не идеальный объект исследования для физики полимеров. Большая длина макромолекулы ДНК, по сравнению с поперечным размером, позволяет рассматривать ее как своеобразную физически одномерную систему. Интерес к физически одномерным системам непрерывно возрастает, начиная со времени появления термодинамической теоремы Ландау-Лифшица о невозможности равновесного существования разных фаз в одномерных системах.
Почти каждый сорт макромолекул полиэлектролитов требует разработки и применения своего собственного типа электрофореза или своей методики. В литературе продолжают появляться все новые и новые методики и устройства для электрофореза, непрерывно повышается его качество и разрешающие способности. В последние годы интенсивно развивается процесс миниатюризации и автоматизации электрофоретических устройств. Появились так называемые микрофлюидные системы, капиллярный электрофорез и биочипы, позволяющие ускорить и автоматизировать процессы фракционирования. Все более популярными становятся гибридные системы, сочетающие гель-электрофорез и другие физические методы, например, хроматографию или масспектрометрию. При этом практические приложения зачастую намного опережают существующие теоретические модели и подходы. В исследовании электрокинегических явлений, несомненно, уже давно назрела необходимость широкого применения теоретических, в том числе - численных методов и моделей, обобщения и систематизации накопленного экспериментального материала.
Задачи исследования динамики полиэлектролитов в электрокинетиче-ских процессах фракционирования многочисленны и разнообразны. Среди
наиболее важных для практики научных проблем в этой области укажем задачу изучения импульсного гель-электрофореза полимерных цепей ДНК, которая до настоящего времени не имела адекватного ее значимости теоретического описания и интерпретации, а также инструментов надежного прогноза рабочих областей параметров и качества фракционирования. В настоящее время импульсный гель-электрофорез, предложенный в работах [6,7] является основным и весьма эффективным методом сепарации длинных полимерных цепей ДНК. Он находит все более широкое применение в биологических и медицинских приложениях. Особенность импульсного гель-электрофреза, как метода фракционирования, состоит в том, что он позволяет разделять фрагменты ДНК размером в сотни тысяч и даже миллионы пар нуклеотидов, когда «обычный» стационарный гель-электрофорез вообще не дает никакого разделения.
В отличие от случая постоянного электрического поля, в импульсном поле у полиэлектролита наблюдается заметная, хотя и не монотонная, зависимость скорости дрейфа от размера полимерной цепи. Эта зависимость меняется с изменением периода электрического поля, что, по мнению автора, указывает на дисперсионный характер этого явления. Автор впервые вводит понятие дисперсии электрокинетической подвижности и связывает его с таким фундаментальным свойством цепных полимеров, как их линейная память [8]. Дисперсия электрокинетической подвижности представляет несомненный интерес для современной физики полимеров и позволяет построить теорию как одномерного, так и двумерного импульсного гель-электрофореза. Вместе с тем, дисперсионный эффект оказывается тесно связан с нелинейным характером электрокинетической подвижности полиэлектролитов в импульсных электрических полях. Изучение дисперсионных и нелинейных свойств подвижности полиэлектролитов в процессах импульсного гель-электрофореза составляет главное направление исследований в настоящей работе.
В работе проводится анализ динамики движения полимерных цепей в импульсных полях и делается вывод о неадекватности диффузионных подходов, основанных на теории рептаций, для описания динамики длинных полимерных цепей в умеренных и сильных полях. Автор развивает альтернативный - «гидродинамический» - подход, учитывающий упругие «энтропийные» силы полимерной цепи, который позволяет преодолеть трудности диффузионного подхода, и открывает новое направление в теоретических исследованиях динамики полимерных цепей. В основу гидродинамического подхода положено полученное методами статистической физики уравнение состояния для отрезка полимерной цепи в одной поре геля, называемого в теории скейлинга - «блобом» [8].
Большое внимание в работе уделено методам электрокинетического фокусирования макромолекул. Методы электрофокусирования имеют наивысшее разрешение среди методов гель-электрофореза, позволяя разделять до тысячи и более фракций в одном сеансе [2, 4]. Предельное разрешение методик фракционирования, достигнутое в методе изоэлектрического фокусирования, до настоящего времени ограничено не очень большими по размерам белками и умеренным диапазоном pH среды. Применение метода фокусирования не только для сепарации белков, но и для других биополимеров остается актуальной нерешенной проблемой. До настоящего времени не была в достаточной степени изучена и проблема устойчивости неоднородных распределений ионов в электрических полях в отсутствии амфолитов. Исследование перечисленных и других важных аспектов метода электрокинетического фокусирования способствует расширению области применения метода и спектра исследуемых с его помощью макромолекул полиэлектролитов.
Еще одно направление данной работы, несмотря на явное преобладание в ней теоретических подходов и методов, связано с прикладным характером исследования. С самого начала работы предполагалось получение результатов прикладного, инновационного характера, в том числе - разработка новых подходов и способов фракционирования и фокусировки макромолекул. На
основе разработанных моделей электрокинетических процессов сепарации в работе предложены и апробированы новые методы сепарации - нелинейный импульсный гель-электрофорез и нелинейная фокусировка в неоднородных электрических полях, а также методика быстрой сепарации длинных фрагментов ДНК, перспективная для биомедицинских приложений.
Электрокинетические процессы тесно связаны с явлением двойного заряженного слоя, всегда возникающего на границе твердой фазы и электролита. Двойной слой и его поляризация во внешнем поле играют определяющую роль во всех электрокинетических процессах и явлениях, а также и в процессах электродной кинетики, протекающих на электродах. Моделирование двойного слоя и электродной кинетики, включая расчет вольтамперных характеристик и моделирование тафелевской зависимости скоростей электродных реакций от потенциала электрода, имеют самостоятельное значение для разработки систем контроля буфера в современных микрофлюидных системах и в капиллярном электрофорезе.
Поведение макромолекул в растворах электролитов, даже в отсутствии внешних полей, представляет собой довольно сложный феномен. В силу этого современную конформационную статистику полимерных цепей, включающую, например, поворотно-изомерную модель [9], учитывающую реальные физические свойства макромолекулы, далеко не всегда удается применить при исследовании динамики движения полимерной молекулы во внешнем поле. Действительно, теория рептаций П. де Жена [10] - первая динамическая теория движения полимеров в геле опирается на один из самых простых подходов - модель идеальной гауссовой цепи, недостатки и ограничения которой хорошо известны [8]. При описании динамики движения полиэлектролитов в геле приходится ограничиваться и сравнительно простыми физическими моделями поддерживающей среды - геля, например, - моделью «трубки» М. Доя и С.Ф. Эдвардса [11]. При этом вне поля зрения исследователя остаются самые современные направления, связанные с физикой восприимчивости и коллапса гелей [12]. Аналогично, классическая теория элек-
трокинетических явлений частиц простой формы [13] остается мало востребованной при рассмотрении современных методик гель-электрофореза биологических макромолекул, поскольку реальные биополимеры не походят на идеальные сферические или цилиндрические частицы, помещенные в электролит и окруженные двойным заряженным слоем.
Сложность и междисциплинарный характер рассматриваемых в работе задач обусловливает выбор подходов и методов их исследования. Широкий круг затрагиваемых разнородных физико-химических проблем и вопросов заставляет обратиться к численному моделированию ряда частных, но важных для практических приложений, задач. В работе широко используются методы численного моделирования. При этом физика полимеров, статистическая физика макромолекул и классические разделы физической химии электролитов составляют основную методическую и теоретическую базу исследования. Вместе с тем, теоретические модели и подходы в работе поддержаны необходимыми электрофоретическими экспериментами.
Целью данной работы является развитие физических основ современных электрокинетических процессов фракционирования и фокусировки полиэлектролитов для повышения эффективности и расширения возможностей существующих и разработки новых практических электрокинетических методик сепарации.
В ходе исследования рассматривались следующие основные задачи, изучение нелинейных и дисперсионных свойств электрокинетиче-ской подвижности макромолекул на примере импульсного гель-электрофореза полимерных цепей ДНК;
разработка теоретических моделей динамики полиэлектролитов, позволяющих объяснять ключевые эксперименты по импульсному гель-электрофорезу;
исследование процессов электрофокусирования полиэлектролитов, включая изоэлектрическое фокусирование и фокусирование в неоднородных электрических полях;
разработка новых - нелинейных методов электрофореза и фокусирования макромолекул и исследование нелинейной электрокинети-ческой подвижности полиэлектролитов;
методические вопросы моделирования электрокинетических явлений и процессов.
Работа выполнена в Новосибирском государственном университете в соответствии с планами научных исследований НИЧ НГУ по темам С-98 и С-01,-02 «Разработка методов и устройств для фракционирования биологических макромолекул».
На защиту выносятся:
1. теоретические модели электрокинетической подвижности полиэлектролитов в импульсных полях и их приложения для описания одномерного и двумерного импульсного гель-электрофореза, включая дисперсионную модель, модель неидеального одномерного газа рептонов и теорию «одномерной гидродинамики», призванную заменить диффузионную теорию рептаций длинных полимерных цепей для случая умеренных и сильных полей;
2. результаты численного моделирования диффузионной теории рептаций и теории «одномерной гидродинамики» на кластере из 11 компьютеров;
3. модели процессов электрокинетического фокусирования макромолекул в градиенте pH и в неоднородных электрических полях, а также критерий устойчивости градиентов pH в задачах изоэлектрического фокусирования. Комплекс программ и алгоритмов для расчета неоднородных электрических полей и моделирования движения макромолекул полиэлектролитов в сеансах импульсного гель-электрофореза и в процессах электрокинетического фокусирования;
4. практические приложения разработанных теоретических моделей:
новый метод нелинейного импульсного гель-электрофореза для сепарации биологических макромолекул, включая фрагменты ДНК и комплексы белков;
новый метод электрокинетического фокусирования макромолекул -нелинейная фокусировка полиэлектролитов в неоднородных электрических полях4
оригинальная методика быстрой сепарации больших фрагментов ДНК для скоростной биомедицинской диагностики бактериальных заражений;
5. результаты экспериментов по наблюдению нелинейной подвижности полимерных цепей ДНК и комплексов белков с ионными детергентами;
6. методические результаты: асимптотическая теория двойного слоя для сферического электрода с учетом сложной кинетики электродных реакций в электролитах и основанный на этой модели алгоритм расчета вольтам-перньтх характеристик, а также его приложения к решению обратных задач электродной кинетики;
Выполненное исследование позволило автору получить ряд новых научных, прикладных и методических результатов:
развита дисперсионная теория электрокинетической подвижности полиэлектролитов, позволившая объяснить ключевые эксперименты но импульсному гель-электрофорезу ДНК и научиться предсказывать области эффективной сепарации;
для описания движения длинных полимерных цепей в импульсных полях предложена новая теория одномерной «гидродинамики», включающая впервые полученное термодинамическое уравнение состояния отрезка цепи в поре геля, а также нелинейное уравнение динамики длины полимерной цепи в геле;
получено аналитическое описание нестационарного процесса электрокинетического фокусирования полиэлектролитов, Исследована устойчивость градиентов pH в электрических полях, в многокомпо-
нентных буферных системах, и получен критерий устойчивости градиентов pH в задачах изоэлектрического фокусирования; на основе теоретических моделей и численных расчетов предложены и апробированы новые методы фракционирования - метод нелинейного импульсного гель-электрофореза и метод нелинейной фокусировки макромолекул в неоднородных электрических полях; в сеансах импульсного гель-электрофореза впервые обнаружена аномальная зависимость нелинейной подвижности от размеров макромолекулы для фрагментов ДНК и комплексов белков и ионных детергентов;
впервые получена нелинейная фокусировка молекул ДНК в неоднородных электрических полях;
предложена и апробирована новая методика быстрой сепарации больших фрагментов ДНК, позволяющая исключить инверсию фракций, увеличить скорость сепарации в 4-5 раз, по сравнению с лучшими мировыми образцами;
На основе асимптотической модели двойного слоя, с учетом сложной электродной кинетики, развит метод оценки параметров в задачах электродной кинетики;
Практическому приложению рассматриваемых в работе теоретических моделей и расчетов в работе уделено особое внимание. Разработанные модели подвижности длинных цепей ДНК и комплексы программ являются необходимыми для практики инструментами прогноза эффективных областей сепарации макромолекул. Нелинейный импульсный электрофорез фрагментов ДНК и комплексов протеинов, нелинейная фокусировка в неоднородных электрических полях обещают решить многие практические проблемы, возникающие в самых современных технологических приложениях электроки-нетических процессов. Методика быстрой сепарации ДНК представляет большой интерес для скоростной биомедицинской диагностики бактериальных заражений.
В соответствии с основными задачами исследования материал диссертации разделен на пять глав. Каждая из них снабжена необходимым введением, в котором дается обзор литературы и постановка задач, рассматриваемых в главе. По завершении каждой главы даются краткие выводы, а в конце работы - заключение, приложение и список цитируемой литературы.
Работа прошла широкую научную апробацию. Полученные результаты докладывались на научных семинарах Кафедры общей физики Физического факультета Новосибирского государственного университета, а также на научных семинарах институтов РАН, в частности, на семинарах Института цитологии и генетики СО РАН, Института химической кинетики и горения СО РАН, Института вычислительных технологий СО РАН, Института теплофизики СО РАН, Института электрохимии РАН (Москва).
Основные результаты докладывались на отечественных и международных конференциях и симпозиумах: на III Генеральной ассамблее Ассоциации азиатских Академий наук -"The Impact of Biotechnological Advance in Asia", 2002 (Израиль), на III международном конгрессе электрофоретических обществ ICES-2001 Верона, (Италия), на VI Симпозиуме "Interface of Regulatory and Analytical Sciences for Biotech Health Products" 2002 (Япония), на международных конференциях "Хроматография высокого давления" HPLC99 (Испания) 1999, XIII международной конференции по диэлектрическим жидкостям, Нара, 1999, (Япония), на VII Португальском и III Иберийском симпозиуме по электрохимии, Фаро (Португалия), 1995, на V международной конференции «Кинетика в аналитической химии», Москва, 1995, Всесоюзной школе-семинаре: «Теория и методы решения некорректно поставленных задач», Новосибирск, 1983, III Всесоюзной школе-конференции по современным методам магнитного удержания, нагрева и диагностики плазмы, Харьков, 1982.
Основные научные результаты исследований опубликованы в ведущих отечественных и мировых научных журналах, а также в материалах научных конференций, симпозиумов и в сборниках научных статей.
Все теоретические результаты и результаты моделирования, вошедшие в диссертацию, получены при определяющем личном участии автора в постановке и решении задач. Программный код дисперсионной модели выполнен автором, код одномерной гидродинамической модели подготовил В.В. Ча-совских, код комплекса “Laplas” - Ю.А. Целовальников. Автор участвовал в постановке, организации и анализе результатов приведенных в работе электрофоретических экспериментов, а сами эксперименты были выполнены С.Е. Пельтеком.
Автор благодарит за сотрудничество своих соавторов, и в особенности -С.Е Пельтека и В.В. Часовских, внесших весомый вклад в совместную работу. Заслугой С.Е. Пельтека - профессионального молекулярного биолога из Института цитологии и генетики СО РАН - является проведение экспериментов по нелинейному гель-электрофорезу биополимеров. На всех этапах работы С.Е. Пельгек щедро делился своими обширными познаниями в области методов сепарации биологических макромолекул.
Необходимые для экспериментов научные приборы и аппаратура, зачастую превосходящие лучшие мировые образцы не только по замыслу, но и по исполнению, а также часть программного обеспечения, были разработаны
В.В. Часовских - сотрудником Кафедры радиофизики Новосибирского государственного университета.
Автор также благодарит за постоянную поддержку руководство Новосибирского государственного университета, в лице ректора - члена-корреспондента РАН Н.С. Диканского, и своих уважаемых коллег -Г.Л. Коткина, A.A. Кочеева, Л.В. Куйбиду, В.В. и З.П. Пай, И.В. Хмелинско-го, Ю.А. Целовальникова, ДА. Шапиро.
1. Дисперсия электрокинетической подвижности и импульсный гель-электрофорез полиэлектролитов
[14-19]
1.1 Введение
Электрокинетическими называют процессы и явления относительного движения электролита и частиц твердой фазы, порождаемые или сопровождающиеся протеканием электрического тока. Этот термин объединяет такие явления как электрофорез - движение заряженных частиц в электролитах под действием внешнего электрического поля, электроосмос - движение раствора электролита вблизи заряженной поверхности, эффект Дорна - появление разности потенциалов в электролите при движении в нем заряженных частиц (потенциалы течения и седиментации), а также, отчасти, эффекты электродной кинетики [20].
Исследование электрокинетических явлений началось в 1809 году, когда Ф.Ф. Рейс опубликовал в московском научном журнале работу [21], где описан свои наблюдения движения воды через дисперсную среду (глину) под действием электрического ноля. Это явление Рейс назвал электроосмосом. Электроосмос представляет собой движение жидкости при пропускании тока через среду, содержащую капилляры. Отметим, что электроосмос играет заметную роль и в современных методиках гель-электрофореза.
В своей работе Рейс заметил также и движение самих заряженных частиц глины в воде под действием электрических сил, но термин «электрофорез» появился почти на сто лет позже.
Электрофорез определяется как миграция заряженных смесей веществ в электролите под действием внешнего электрического поля. Разница в скорости миграции компонентов смеси, обусловленная различиями зарядов, формы и размеров составляющих ее частиц, приводит к разделению (сепарации) частиц на отдельные зоны - фракции.
Теоретические основы электрофореза, без которых невозможно практическое применение метода, восходят к работам Гельмгольца [22], Кольрауша [23], Смолуховского [24] и других (см. главу 1 книги [13] и список литературы к этой главе).
В начале прошлого века, благодаря усилиям шведской научной школы физической химии во главе с А. Тизелиусом, электрофорез был доведен до уровня аналитической методики [25] и в 1948 году отмечен Нобелевской премии по химии.
Большой вклад в разработку теоретических основ электрофореза внесла отечественная научная школа, в частности, С .С. Духин и Б.В. Дерягин, чья монография [13] и по сей день является настольной книгой исследователей в этой области. В ней заложены теоретические основы электрофореза частиц правильной формы (сферических и цилиндрических), опирающиеся на теорию поляризации двойного заряженного слоя в электролитах.
Р1еобходимо также отметить работы харьковской научной школы, в частности, Г.В. Троицкого, в области разработки электрокинетических методов фракционирования белков. Использование прецизионных оптических (ин-герферометрических) методов регистрации позволило Троицкому с сотрудниками достичь выдающихся результатов в сепарации белков и других макромолекул [26].
Особый вклад в теоретические исследования электрокинетических процессов и явлений внес В. Г. Левич. В его книге «Физико-химическая гидродинамика» [20], наряду научными результатами, определены и основные методические подходы и ориентиры в этой области.
Многие практические вопросы проведения электрофореза и в особенности - гель-электрофореза и электрофокусирования биополимеров, подробно рассмотрены в монографиях Л.А. Остермана [1,2]. Несмотря на то, что со времени издания этих монографий уже прошла четверть века, изложенный в них материал остается вполне современным и актуальным. Монографии содержат подробное описание способов подготовки, заливки и полимеризации
геля (агарозного, полиакриламидного и их смесей), приемов внесения разделяемой смеси, режимов разделения различных биологических макромолекул, способов их окраски и элюции и т.п. Там же обсуждаются важнейшие, этапные методики гель-электрофореза - 018С-электрофорез по Орнштейну и Девису, разделение белков по размерам, с применением ионного детергента до-децил сульфата натрия (ДСН) по методу Леммли, изоэлектрическое фокусирование белков в градиенте pH с использованием амфолитов по Рильбе (Свенссону), двумерный электрофорез белков по методу О’Фаррелла, ставший в настоящее время основным методом современной протеомики (раздела молекулярной биологии, изучающего природные белки). Даже гибридные системы, сочетающие гель-электрофорез с другими методами, например - с хроматографией, уже были отмечены в этих монографиях. Единственный, не представленный в них современный метод фракционирования - импульсный гель-электрофорез, еще не был известен на момент их издания.
Методики электрокинетичсского фракционирования в процессе сепарации используют разнообразные поддерживающие среды - носители: сефа-декс, ацетат-целлюлозу, крахмальный, полиакриламидный и агарозный гели, а также и их смеси. Наибольшее практическое значение в качестве поддерживающей среды в настоящее время приобрели гели. Трудно переоценить роль геля как поддерживающей среды, которая состоит в подавлении конвективных движений жидкости. Тепло, выделяемое при протекании тока через электролит, приводит к конвективной неустойчивости слоев электролита. Поддерживающая среда, такая как гель, благодаря малым размерам ее капилляров, способна полностью подавить конвекцию, что обеспечивает качественное разделение фракций исследуемых макромолекул. Заметим также, что в последние годы интерес к физике гелей заметно возрос в связи с изучением явлений самоорганизации ион-содержащих полимеров [27].
Теоретические исследования движения полимерных макромолекул до недавнего времени ограничивались рассмотрением равновесных конформаций, для которых было развито большое число теоретических моделей (иде-
альная гауссова цепь, свободно-сочлененная цепь, полимерная цепь Порода-Кратки и др.) и получены разнообразные статистические характеристики распределения геометрических и физических параметров цепей [9,28-31]. Проводя аналогии с механикой, можно сказать, что эти классические модели описывают «статику» полимерной цепи в отсутствии внешних полей. «Динамика» движения полимерной цепи во внешнем силовом поле изучена в значительно меньшей степени, однако именно динамические задачи представляют наибольший интерес для современного импульсного гель-электрофореза. Классические динамические модели движения полимерных молекул в электролите в отсутствии геля были предложены П.Е. Раусом [32] и Б. Зиммом [33]. В отличие от этих моделей, где макромолекулы движутся под действием внешних сил в растворе электролита, диффузионная теория рептаций П. де Жена [10] существенно учитывает наличие препятствий, возникающих в геле в процессе движения полимерной цепи. Наиболее подробно в отечественной литературе теория рептаций представлена в известной книге А.Ю. Гросберга и А.Р. Хохлова “Статистическая физика макромолекул” [8]. Там же представлена и концепция скейлинга [34], которая, наряду с другими методами теоретической физики, в настоящее время становится одним из основных теоретических подходов в физике полимеров.
Динамические модели движения макромолекул полиэлектролитов в переменных полях имеют особое значение для современного импульсного гель-электрофреза. Импульсный гель-электрофорез широко применяется для разделения длинных заряженных (двухцепочечных) фрагментов ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты) [6,7,35-39]. Открытие зависимости подвижности молекул ДНК от периода поля в переменных электрических полях привело к появлению таких современных методов сепарации, как двумерный импульсный гель-электрофорез - CFGE (Crossed-Field Gel Electrophoresis) [6] и одномерный инверсионный импульсный гель-электрофорез - F1GE (Field Inversion Gel Electrophoresis) [7].
В двумерном импульсном гель-электрофорезе электрическое поле периодически меняет свое направление на некоторый угол, что обеспечивается наличием нескольких электродов в электролите, окружающем слой геля. В процессе сеанса двумерного гель-электрофореза амплитуда электрического поля обычно остается постоянной, а изменяется только направление действия электрического поля в рабочей плоскости геля. Как показывает эксперимент, наилучшее разделение смеси достигается при угле изменения поля, близком к 120 градусам [40,41]. Двумерный импульсный гель-электрофорез обеспечивает высокое качество фракционирования макромолекул ДНК, но дорогая и сравнительно сложная многоэлектродная система подачи и контроля напряжения ограничивает его широкое применение.
Одномерный инверсионный импульсный гель-электрофорез, появившийся на четыре года позже двумерного, использует всего два электрода, как и «обычный» стационарный гель-электрофорез. Полярность электродов в сеансе инверсионного гель-электрофореза периодически меняется на противоположную - инвертируется. Качество разделения макромолекул в одномерном инверсионном гель-электрофорезе практически не уступает результату достигаемому в сеансе двумерного гель-электрофореза [7].
Как уже отмечалось выше, в отличие от электрофореза в постоянном поле, позволяющего проводить разделение только сравнительно небольших макромолекул (до 30-40 тысяч пар нуклеотидов - тпн), переменные во времени или в пространстве электрические поля делят полимерные цепи ДНК размером в сотни тысяч и миллионы пар нуклеотидов. Для иллюстрации отличий стационарного и одномерного инверсионного гель-электрофореза на Рис. 1 и Рис. 2 соответственно, схематически представлены соответствующие зависимости скорости дрейфа макромолекул от размера цепи I.
23
Рис. 1. Стационарный гель-электрофорез полимерных цепей ДНК. Зависимость скорости £/(] дрейфа цепи от ее размера I.
Рис. 2. Инверсионный импульсный гель-электрофорез (F1GE) длинных полимерных цепей ДНК. Зависимость скорости дрейфа l/d цепи от ее размера L. Минимум скорости (подвижности) называют «антирезонансом».
В основе импульсных методов фракционирования лежат такие аномалии скорости (подвижности) макромолекул, схематично представленные на Рис. 2, как «антирезонанс» - глубокий минимум скорости и инверсия фракций, возникающие при определенных соотношениях между периодом изменения поля и размером цепи ДНК.
Вместе с тем, несмотря на почти двадцатилетнюю историю исследований импульсного гель-электрофреза и их особого значения для приложений, физические причины появления таких аномалий подвижности, как «антирезонанс» и инверсия фракций [42-47], до настоящего времени не были достаточно изучены. Практически не получили интерпретации детальные эксперименты, проведенные в работе [42] по измерению мгновенных скоростей движения фракций ДНК во время положительного и отрицательного импульсов поля. До сих пор не было получено теоретическое обоснование оптимальных углов разделения в двумерном импульсном гель-электрофорезе [40,41].
Автор полагает, что зависимость скорости дрейфа полиэлектролитов от периода поля в импульсных полях указывает на дисперсионный характер явления «антирезонанса». Дисперсия электрокинетической подвижности, обусловленная линейной памятью цепного полимера, как сравнительно новый для данной области физический эффект, представляет значительный интерес не только для исследования электрокинетических процессов фракционирования макромолекул, но и для физики полимеров в целом.
В литературе представлен ряд теоретических моделей, применявшихся для описания движения ДНК в геле, как в постоянных, так и в переменных электрических полях. Практически все существующие теоретические подходы опираются на диффузионную теорию рептаций - первую динамическую теорию движения полимерных цепей в геле. Сравнительно полный обзор существующих моделей и теорий гель-электрофореза полиэлектролитов был недавно приведен в обзоре [46], а также в более раннем обзоре [47]. В рамках