Оглавление
ОГЛАВЛЕНИЕ....................................................................3
ВВЕДЕНИЕ.....................................................................5
ГЛАВА 1. АНАЛИЗ ВЫСОКОСКОРОСТНЫХ МЕТОДОВ МИКРОСКОПИИ БИОЛОГ ИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ.....................................................12
1.1 Атомно-силовая микроскопия локальных наномеханических колебаний клеточной стенки хлебопекарных дрожжей................................................12
1.2 Трехмерная флуоресцентная микроскопия многофотонного возбуждения для исследования динамики эритроцитов...........................................17
1.3 Высокоскоростная конфокальная микроскопия медленных изменений морфологии кардиомиоцитов и клеток HeLa................................................21
1.4 Лазерная интерференционной микроскопии как альтернатива традиционным методам оптической микроскопии......................................................24
1.4.1 Гильберт-фазовая микроскопия динамики эритроцитов...................24
1.4.2. Оптическая когерентная томография клеток крови.....................29
1.4.3 Динамическая микрофогометрия фликкера эритроцитов...................35
1.4.4 Когерентная фазовая микроскопия динамики биологических объектов.....40
1.4.5 Модуляционная интерференционная микроскопия внутриклеточных и мембранных процессов в нейронах.........................................43
ГЛАВА 2. РАЗВИТИЕ МЕТОДОВ ЛАЗЕРНОЙ ИНТЕРФЕРЕНЦИОННОЙ МИКРОСКОПИИ ДЛЯ РЕГИСТРАЦИИ МОРФОЛОГИИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ДИНАМИКИ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ.................................................48
2.1 Метод локальной динамической микроскопии для регистрации внутриклеточной динамики в реальном времени.................................................48
2.1.1. Модуляционный метод воспроизведения низкочастотных флуктуаций фазовой толщины.................................................................60
2.1.2. Программное обеспечение метода локальной динамической микроскопии 63
2.2 Новое поколение высокоскоростных модуляционных интерференционных микроскопов МИМ для исследования биологических объектов.....................81
2.3 К вопросу о разрешении в интерференционной микроскопии..................86
2.3.1. Дифракционная модель сверхразрешения...............................100
2.3.2 Метод топологических фаз............................................107
2.3.3. Компенсационный метод измерения фазы...............................110
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕН ТАЛЬНОЕ ОПРОБОВАНИЕ МЕТОДОВ ЛОКАЛЬНОЙ ДИНАМИЧЕСКОЙ И МОДУЛЯЦИОННОЙ ИНТЕРФЕРЕНЦИОННОЙ ЛАЗЕРНОЙ МИКРОСКОПИИ НА БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ......................................114
3.1 Исследование активации лимфоцитов.......................................114
г-з
3.2 Исследование изменений в морфологии эритроцитов при оксигенировании. 121
3.3 Определение жизнеспособности спор Nozema Apis методом модуляционной интерференционной микроскопии........................................... 130
3.4 Исследование спонтанной самоорганизации газовых микропузырей в жидкости методом модуляционной интерференционной микроскопии......................134
3.5 Локализация «голосов» эритроцитов....................................146
3.6 Исследование динамики нервных волокон методом модуляционной интерференционной микроскопии............................................151
3.7 НСТ-116 Интерактивный диалог с клеткой...............................159
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.............................................................163
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК.................................................166
ПРИЛОЖНИЕ А..............................................................184
ПРИЛОЖПИЕ Б...........................ОШИБКА! ЗАКЛАДКА НЕ ОПРЕДЕЛЕНА.
4
Введение
Современный уровень развития оптической электроники и вычислительной техники позволяет создавать и успешно внедрять новые инструменты исследования биологических объектов. Последние достижения в области компьютерной микроскопии и томографии [1-7] в сочетании с автоматизированными системами распознавания образов широко используются в качестве исследовательских и диагностических инструментов в биологии и медицине.
Исследования корреляции между функциональным состоянием отдельной клетки и физическими параметрами ее органелл является одной из актуальных проблем биологии [8-10]. Ее решение будет иметь фундаментальное значение для понимания внутриклеточной динамики, а также откроет перспективу разработки новых методов диагностики в молекулярной медицине. Практически важными приложениями таких методов являются скрининг биологически активных соединений и экспресс-диагностика ряда заболеваний на клеточном уровне [11].
Исследования в области динамики внутриклеточных процессов, таких как кинетика молекулярных моторов [12], кооперативные явления в мембранах и ферментных комплексах [13] и т.п. стимулировали дальнейший прогресс в развитии новых методов «прижизненной» микроскопии. Возникла острая необходимость регистрации динамических процессов в реальном времени.
В настоящее время для анализа динамических процессов в биологических объектах используются методы атомно-силовой микроскопии [14-17], однако вследствие инвазивности экспериментов
5
применение подобных методов для исследования клеток мягких тканей ограничено.
Использование современных методов высокоскоростной конфокальной микроскопии при [19-22] исследовании быстрых (более 10 Гц) динамических процессов также ограничено вследствие низкого пространственного и временного разрешения.
Значительных результатов в исследовании внутриклеточных процессов удалось достичь, используя метод флуоресцентной микроскопии [18]. При известных ограничениях и некой степени инвазивности этот метод позволяет получить количественную информацию о пространственно-временных флуктуациях мембранного потенциала. Однако ощутимых результатов в решении задач диагностики функциональных состояний субклеточной системы, метод традиционной флуоресцентной микроскопии не даёт. Это объясняется, в первую очередь, отсутствием механизма абсолютной нормировки интенсивности флуоресценции, а также сравнительно низкой чувствительностью и малым временным разрешением, которые ограничены в данном методе.
Наиболее перспективными оказываются методы
интерференционной микроскопии, такие как когерентная фазовая [33] и динамическая фазовая [37] микроскопия, которые позволяют осуществлять неинвазивные исследования клеточной морфологии и динамики со сверхвысоким пространственным разрешением. Метод динамической фазовой микроскопии оказался весьма универсальным инструментом, охватывающим широкий класс биообъектов и регистрирующим динамические процессы с частотами от 0,05 до 500 Гц. Кроме того, высокое пространственное разрешение прибора, позволяет исследовать динамику отдельных органелл клетки.
6
В процессе реализации методов динамической фазовой микроскопии была выявлена непригодность классического критерия Релея в фазовых изображениях и возможность сверхразрешения [35].
Применение этих методов в биофизике позволило исследовать пространственно-временные флуктуации в органеллах клеток и поучить ряд принципиально новых научных результатов [38-46].
Целыо настоящей работы было развитие методов когерентной фазовой и модуляционной интерференционной микроскопии интерференционной микроскопии как новой методологической базы для исследования морфологии и динамики биологических объектов в реальном времени. Следовало показать, что использование достижений оптической электроники позволяет увеличивать быстродействие существующих методов микроскопии для исследования динамики биообъектов в реальном времени. Результатом исследования должна быть новая информация о корреляции фазовой микроморфологии и внутриклеточной динамики с функциональным состоянием биологических объектов.
Предметом исследования были выбраны эритроциты и лимфоциты человека, нервные волокна лягушки, опухолевые клетки и пчелиные споры. Такой спектр объектов не случаен и объясняется желанием расширить возможности метода при исследовании широкого круга биологических объектов; кроме того, подобные исследования представляют актуальность для медицины, биофизики и ветеринарии.
Основные задачи работы:
1. Разработать набор дополнительных модулей к экспериментальной установке для реализации метода локальной динамической микроскопии;
7
2. Разработать современное программное обеспечение для
регистрации обработки и анализа динамических процессов в
реальном времени;
3. Реализовать модуляционный метод воспроизведения
низкочастотных флуктуаций фазовой толщины;
4. Провести апробацию методов когерентной фазовой и
модуляционной интерференционной микроскопии на биологических объектах и сделать следующие эксперименты:
- Исследовать зависимость морфологии и характера динамических процессов в эритроцитах от степени их оксигенирования;
- Исследовать изменение морфологии лимфоцитов при их активации;
- Исследовать действие метаболических ингибиторов на опухолевые клетки НСТ-116;
- Исследовать различия в морфологии нормальных и
инактивированных спор Nosema Apis;
- Определить параметры газовых микропузырей, спонтанно
возникающих в водных средах;
- Показать, что применение техники Wavelet анализа позволяет выявлять нестационарные динамические процессы в нервных
волокнах;
- Дать биофизическую интерпретацию полученным результатам. Краткая аннотация содержания работы:
Во введении кратко обоснована актуальность научной проблемы, описано состояние проблемы в настоящее время, обозначены цели и задачи исследования, приведены сведения о публикации результатов диссертационных исследований автора и краткие сведения о внедрении результатов исследования.
8
В первой главе отражен анализ известного научно-методического аппарата для исследования морфологии и динамики биологических объектов в реальном времени и показана необходимость его совершенствования. Описаны основные методы, использующиеся для анализа клеточной морфологии и динамики внутриклеточных процессов в биологических объектах, приведены основные результаты работ по обозначенной тематике. В качестве наиболее перспективных выделены методы интерференционной микроскопии и показаны достижения этих методов в области исследования клеточной морфологии и динамики внутриклеточных процессов. В завершении первой главы сформулированы основные выводы и частные задачи исследования.
Во второй главе приведены описания методов локальной динамической и модуляционной интерференционной микроскопии, приведены описания экспериментальных установок, на которых выполнялась работа. Рассмотрено программное обеспечение, разработанное для исследования биологических объектов в реальном времени. Показаны основные преимущества и недостатки описанных методов, а также перспективы их развития.
Третья глава посвящена экспериментальному обоснованию научных результатов работы. В этом разделе приведены основные методики и результаты исследования морфологии и динамики различных биологических объектов. Показано, что методы локальной динамической и модуляционной интерференционной микроскопии могут быть использованы для оценки функционального состояния клеток крови, нейронов, спор и опухолевых клеток по ряду морфологических признаков и динамических характеристик.
В заключении формулируются выводы но основным научным результатам исследования, подчеркиваются элементы новизны и вклада, вносимого автором, приводятся сведения об апробации результатов и
9
опубликовании основных материалов диссертационных исследований, отмечаются вопросы, которые не удалось решить, и которые могут служить предметом дальнейших исследований.
Основные положения, вносимые на защиту
1. Предлагаемый автором приборно-методический комплекс может быть использован для неинвазивного исследования морфологии и динамики биологических объектов в реальном времени со сверхвысоким пространственным разрешением.
2. Ввиду относительной простоты и приемлемой точности получаемых результатов методы когерентной фазовой и модуляционной интерференционной микроскопии могут быть использованы для оценки функционального состояния биологических объектов по ряду морфологических параметров;
3. Результаты проведенных исследований позволяют утверждать что:
- Метод локальной динамической микроскопии позволяет
исследован» внутриклеточные процессы биообъектов в реальном времени, что позволяет оценивать их функциональное состояние.
- Фазовая толщина биологических объектов, регистрируемая
методами локальной динамической и модуляционной интерференционной микроскопии, является объективным
количественным параметром, отражающим функциональное состояние ряда биологических объектов.
10
Краткие сведения о публикации результатов диссертационной работы
По результатам диссертационной работы автором опубликовано 26 научных работы, 12 из которых входят в перечень изданий ВАК для защиты кандидатских и докторских диссертаций. Основные результаты диссертационной работы доложены на 10 научно-практических конференциях, 7 из которых международные.
Сведения о внедрении результатов исследования
По результатам диссертационной работы разработаны методические указания но определению жизнеспособности микроспоридий рода Позема методом лазерной интерференционной микроскопии.
Благодарности
Научному руководителю Бункину П.Ф. за помощь в организации работ по теме диссертации, консультанту по спец. части Индукаеву К.В. за помощь в модификации экспериментальной установки, консультанту по биологической части Вышенской Т.В. за помощь в проведении экспериментов и интерпретации результатов, сотрудникам кафедры биофизики биологического факультета МГУ им. Ломоносова и лично профессору Максимову Г.В. за помощь в подготовке экспериментов и биофизической интерпретации полученных результатов, сотрудникам Академической группы Московского областного научно-исследовательского клинического института им. Владимирского за помощь в приготовлении образцов лимфоцитов, руководству ООО «Лаборатории Амфора» за предоставленный для исследований микроскоп МИМ-310.
11
Глава 1. Анализ высокоскоростных методов микроскопии биологических объектов
1.1 Атомно-силовая микроскопия локальных наномеханических колебаний клеточной стенки хлебопекарных дрожжей
Напомеханическис свойства клеточной мембраны являются ключевым параметром при исследовании клеточной физиологии. Наномеханические свойства играют важную роль во многих биологических процессах, таких как метастатический потенциал, сигнальные цепи и жизнеспособность.
Известно, что атомно-силовая микроскопия (ACM) позволяет получать топографические изображения с высоким разрешением при физиологически контролируемых условиях, расширяя многообразие локальных зондовых экспериментов. Высокое пространственное разрешение атомно-силового микроскопа в сочетании с его способностью работать в жидкости, позволяет ему работать с живыми биологическими системами, например клетками. В работах [14-17) Атомно-силовая микроскопия использовалась для измерения механических биений кардиомиоцитов, а также колебаний клеточных мембран фибробластов и клеток человеческих эмбрионов.
Принципиально новая информация получена в работе [14], выяснилось, что клеточная стенка Saccharomyces cerevisiae (хлебопекарных дрожжей) имеет локализованные температурно-зависимые наномеханические колебания с определенными частотами (0.98 - 1.7 КГц) и амплитудами (1-7 нм). Измеренные наномеханические колебания имеют энергию активации 58 кДж/моль, что хорошо согласуется с клеточной энергетикой, и предполагает возможную связь с молекулярными моторами. Показано, что в 60% всех экспериментальных исследований, амплитуды
12
колебаний клеточной стенки и почечного рубца характеризовались двумя состояниями.
в г7* ' 4
V и
5 ип’
ю
I
Рисунок 1.1.1 - Многослойная культура дрожжей (а), отдельные клетки дрожжей, полученные путем пропускания культуры через 5 мкм фильтр (Ь) (стрелка 1) и с использованием механического захвата (стрелка 2), силовые кривые (с), полученные путем исследования отклонения кантилевера, схема экспериментальной установки (сі).
Показано, что наблюдаемые сигналы были исключительно периодическими, и средняя их амплитуда составляла 3,0 + 0,5 нм (Рисунок 1.1.2).
А 1НАШ1ЫШН. Р I
У!
ттш 'шіш
Рисунок 1.1.2 - Типичные временные колебания клеточной стенки (А - 3) и распределения амплитуд колебаний живых леток (К) и ингибированных азидом натрия (Ь).
13
Фурье преобразование показало изменение характерных частот с повторяющимся пиком в районе 1.6 КГц (Рисунок 1.1.3.(А)).
А
В
Frequency (kHz)
Frequency (kHz)
С ,9'
D „
•г* іс4'
I
I
4
Frequency (kHz)
Frequency (kHz)
Рисунок 1.1.3 - Спектры колебаний клеточной стенки дрожжей при температуре 30°С (А), при 26°С (В), при 22°С (С) и при ингибировании азидом натрия (О)
Результаты свидетельствуют о том, что механические колебания вызваны одним или двумя внутриклеточными процессами. Удалось разделить вклад этих процессов, воздействуя на клетки азидом натрия ЫаЫ3 -хорошо известного метаболического ингибитора, который блокирует синтез АТФ в митохондриях. Колебания, исследованные в клетках с азидом натрия - непериодические со средней амплитудой 0.4+0.2 нм (Рисунок 1.1.2 Н) с Гауссовой формой распределения, в то время как амплитуды колебаний живых клеток всегда распределены по биномиальному закону (Рисунок 1.1.2.
В работе [15] для облегчения и удобства анализа, информация была преобразована в спектрограммы, по методу сходному с тем, что в основном используется для звукового анализа (сонограммы). После 15 секундной записи информации на спектрограмме появлялся пик в области 1.6 КГц
К и L).
14
(рисунок 1.1.4 а), исследование спектрограммы БГ1Ф показало, что амплитуда главного пика 1.6 КГц сильно изменялась во времени.
Ь)1101 1
1а'
< 1С* ООО
I'"'’
1-25
2.50
1а’
1а’
5 10
Т1то (вес)
ООО 1X 2 50
| 10'| з
10‘
ООО
СО ^ 10 1
1 ал
Ягвоивпсу (кНг)
2.60
0.5
в) |,*
1.60
и. 1.56
0.0
1.0«
0.5
» 12 Т1т* (•)
1в
0.0
АтрМийе (пт)
А
160 101 1« 1.вЭ
ргецоепсу (кНг)
Рисунок 1.1.4 Спектрограмма (а) записанная на почечном рубце, амплитудные спектры (Ь), амплитудная (с) и частотная (е) модуляция, распределение амплитуд для клеток в норме (с!) и при действии азида натрия
(О
Приведенные результаты четко показывают, что изменение частот не может быть вызвано механическими резонансами клетки или малыми паразитными резонансами АСМ. Исследованная температурная зависимость сдвига частоты и исчезновение каких-либо колебательных движений при воздействии на клетки азидом натрия дает основание предполагать, что зафиксированные колебания имеют метаболическую природу.
Из анализа работ [14-17] по атомно-силовой микроскопии биологических объектов следует, что АСМ позволяет исследовать
15
биологические объекты с разрешением, существенно превосходящим оптические микроскопы (например, визуализировать выделенные молекулы ДНК), однако имеет ряд недостатков:
- Контактность. При использовании современных методик измерений в жидких средах применение АСМ для исследования мягких клеток тканей и крови весьма ограничено.
- Диапазон измерения динамических процессов клетки 100 Гц - 10 КГц не позволяет исследовать медленные динамические < 1 Гц процессы, имеющие место в большинстве растительных и животных клеток.
В настоящее время ведущие разработчики атомно-силовых микроскопов разрабатывают огромное количество бесконтактных методик для исследования биологических объектов, однако применение этих методик также ограничено вследствие взаимодействия заряженного зонда АСМ с заряженными мембранами живых клеток. Наблюдается четкая тенденция интеграции измерительных атомно-силовых микроскопов в конфокальные и оптические микроскопы. Полученные в результате такой интеграции изображения позволяют осуществлять комплексное исследование свойств биологических объектов.
16
1.2 Трехмерная флуоресцентная микроскопия многофотонного возбуждения для исследования динамики эритроцитов
Известно, что микроскопия многофотонного возбуждения (ММВ) находит широкое применение при исследовании медленных (до 10 Гц) изменений в живых клетках. Основные преимущества над лазерной конфокальной и сканирующей зондовой микроскопией заключаются в использовании неразрушающих инфракрасных источников излучения, в снижении рассеяния и использовании красителей возбуждающихся в ближнем ИК диапазоне.
ММВ разделяет один недостаток с лазерными сканирующими микроскопами (СЬ8М) - низкую частоту кадров. Изображения в этих методах должны восстанавливаться пиксель за пикселем с частотой 1-2 кадра в секунду, по этому такая техника не допустима для исследования ряда быстрых биологических процессов.
В работах [18-20] для увеличения скорости получения изображений применяется различные методы, такие как линейное сканирование, многоугольные зеркала, резонансные сканеры и массивы микролинз. Проблема массивов микролинз заключаются в низкой пропускной способности, несовпадением фокусов и наличии аберраций.
В рассматриваемой в работе [20] установке, применяется специальный светоделитель, состоящий из плоских оптических компонентов, который разделяет падающий лазерный пучок на N составляющих. Разделенные пучки соединяются в микроскопе и одновременно сканируют плоскость предмета, увеличение скорости ввода изображения по фактору Ы; зависит от мощности лазера, а количество сканирующих пучков может достигать 256.
17
- Київ+380960830922