РОЗДІЛ 2
ДОСЛІДЖЕННЯ ХІМІЧНОГО СКЛАДУ КОРЕНІВ, ТРАВИ ТА ПЛОДІВ РОЗТОРОПШІ ПЛЯМИСТОЇ З ВИДІЛЕННЯМ І ВСТАНОВЛЕННЯМ СТРУКТУРИ ОТРИМАНИХ БІОЛОГІЧНО АКТИВНИХ СПОЛУК
2.1. Короткі відомості про прилади, методи і реактиви
Для досліджень БАР ми використовували метод висхідної і низхідної одномірної, двомірної і багаторазової хроматографії на папері (ПХ) та хроматографії в тонкому шарі (ТШХ). Результати значення Rf на хроматограмах є середніми величинами 5-6 визначень.
Для хроматографування застосовували різні сорти паперу "Filtrak" (F N l,3,7,14), пластинки "Silufol UV-254", " Silufol UV-366" (Чехія) та "Sorbfil"-ПТСХ-А-УФ.
1. Розчинники для приготування хроматографічних систем ми використовували кваліфікації ч.д.а. або х.ч.; співвідношення розчинників, позначені цифрами, взяті в об'ємних одиницях. Для хроматографування використовували наступні системи розчинників.
№ 1 - н-бутанол-оцтова кислота-вода БОВ (4:1:2);
№ 2 - 2 % оцтова кислота;
№ 3 - 15 % оцтова кислота;
№ 4 - хлороформ (формамід 25 %);
№ 5 - хлороформ - оцтова кислота - вода (13:6:2);
№ 6 - етилацетат-оцтова кислота-мурашина кислота-вода (100:11:11:25);
№ 7 - етилацетат-мурашина кислота-вода (3:1:1);
№ 8 - ацетон-н-бутанол-вода (7:2:1);
№ 9 - 5 % оцтова кислота;
№ 10 - 1 % кислота хлоридна;
№ 11 - оцтова кислота-концентрована кислота хлоридна - вода (5:1:5);
№ 12 - гексан-ацетон (6:2);
№ 13 - гексан-ацетон (6:4);
№ 14 - гексан-ацетон (8:1);
№ 15 - хлороформ-метанол (9:1);
№ 16 - петролейний ефір-хлороформ-етилацетат (3:2:1)
2. На хроматограмах речовини виявляли до і після обробки різними реактивами за забарвленням у денному світлі та за флуоресценцією їх у фільтрованому УФ-світлі:
А - 3% розчином заліза хлориду (ІІІ);
Б - діазореактивом;
В- парами аміаку;
Д - 10% спиртовим розчином натрію гідроксиду;
Е - анілінфталатним реактивом (0,33 г аніліну та 1,66 г кислоти фталевої в 100 мл н-бутанолу, насиченого водою);
Ж - 0,1% розчином нінгідрину в етиловому спирті;
З - 10% розчином кислоти сірчаної;
К - 20 % розчином кислоти сірчаної;
Л - 1% спиртовим розчином алюмінію хлориду;
М - 5 % спиртовим розчином алюмінію хлориду;
Н - реактивом Бартона (рівні об'єми 0,1% розчинів хлориду окисного заліза (III) і калію ферриціаніду );
П- розчином ваніліну в концентрованій кислоті сірчаній;
Р -10% розчином кислоти фосфорновольфрамової;
С-реактив Шталя;
3. Для хроматографічного розділення речовин, що досліджували, використовували целюлозу (фракція 0,25-0,5 мм), силікагель марки КСК з розміром часток 0,25 мм, марки LS 100/250 і порошок поліамідного сорбенту з розміром часток 0,25 мм.
4. Речовини аналізували після двох-, трикратної кристалізації з відповідних розчинників і висушуванні у вакуумі при 10-2 мм рт. ст. над фосфорним ангідридом протягом 4-х год при 110°С.
5. Температуру плавлення визначали на блоці Кофлера.
6. УФ-спектри поглинання знімали на спектрофотометрах СФ-46 і "Speсord UV-Vis" у кюветах з товщиною шару 10 мм при концентрації речовин 1-2.10-3 моль в етанолі.
7. ІЧ-спектри знімали на спектрометрі UR-20 (Німеччина) в таблетках калію броміду 1 мм заввишки при співвідношенні речовини і наповнювача 1:200-1:400.
8. ПМР-спектри записували на приладі Brulcer wp-100 з робочою частотою 100 мГц у диметилсульфоксиді і дейтерованому хлороформі, внутрішній стандарт - тетраметилсілан (ТМС).
9. Оптичну активність глікозидів вимірювали на поляриметрі
СПУ-Е.
10. Амінокислотний склад визначали на аналізаторі LKB 4151 "Альфа Плюс" (Швеція) на колонці, заповненій іонообмінною смолою марки DCGA.
11. Жирнокислотний склад ліпофільного комплексу визначали на хроматографі "Chrom-5".
12. Визначення елементного складу проводили на спектрометрі С-115М і приладі ФПА-1.
13. Дослідження ліпофільного екстракту проводили за допомогою тривимірної скануючої спектрофлуориметрії в УФ-світлі та видимому діапазонах спектру, використовуючи спектрофлуориметр Hitachi F 4010.
14. Мікропрепарати для вивчення анатомічної будови трави, коренів та насіння розторопші плямистої готували із свіжозібраної, фіксованої в суміші спирт - гліцерин - вода (1:1:1) сировини; вивчали під мікроскопами МБР-1 і при збільшенні в 80, 200 і 400 разів. Діагностичні ознаки фотографували фотоапаратом "ФЕД-5" на плівку "Мікрат-200".
2.2. Дослідження якісного складу біологічно активних речовин коренів, трави, плодів та олії розторопші плямистої
Об'єктами наших досліджень були корені, трава, плоди та олія розторопші плямистої. Корені, трава та плоди розторопші були зібрані в Полтавській області в 2005-2006 роках. Олія розторопші є відходом виробництва препарату "Силібор" та була надана нам ВАТ "ФК Здоров'я". Для встановлення якісного складу використовували загальноприйняті методи досліджень - якісні хімічні реакції, ПХ, ТШХ.
Для приготування водних екстрактів 50,0 г сухої сировини, подрібненої до розміру часток 2-3 мм, заливали 200 мл води і нагрівали зі зворотнім холодильником на киплячому водяному огрівнику протягом 1 год. Отриману витяжку фільтрували через складчастий фільтр. Екстракцію сировини проводили двічі новими порціями розчинника. Об'єднаний екстракт концентрували у вакуумі до 50 мл і використовували для визначення вуглеводів, амінокислот, дубильних речовин, гідроксикоричних кислот.
Водно-спиртові екстракти отримували аналогічним чином. Як екстрагент використовували 50 % етиловий спирт. Водно-спиртову витяжку використовували для визначення флавоноїдів та тритерпеноїдів [193].
Для проведення якісних реакцій на антоціани 10,0 г подрібненої трави заливали 10 мл 1 % спиртового розчину кислоти хлоридної, кип'ятили на киплячому водяному огрівнику протягом 15 хв. Витяжку охолоджували, фільтрували, з фільтратом проводили якісні реакції на антоціани [11, 27, 233].
2.2.1. Визначення вільних і зв'язаних цукрів.1. З реактивом Фелінга. У дві мірні колби