ОГЛАВЛЕНИЕ
Стр.
ВВЕДЕНИЕ..................................................... 4-14
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................... 15-76
1.1. Свойства и цикл развития хламидий. Взаимодействие
с клеткой-хозяином.................................. 15-49
1.2. Хламидиоз кошек и собак........................ 50-54
1.3. Антигенная структура хламидий и получение антихла-мидийных моноклональных антител..................... 55-59
1.4. Молекулярно-генетический подход в диагностике хла-мидиозов животных и птиц на основе полимеразной цепной реакции ....................................... 60-75 .
ГЛАВА 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ................... 77-107
2.1. Материалы и методы............................. 77-82
2.2. Методы исследований............................ 83-107
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ................................................. 108-217
3.1. Выделение хламидий в развивающихся куриных эмбрионах............................................. 108-116
3.2. Выделение хламидий в культуре клеток McCoy..... 117-121
3.3. Ультраструктурная характеристика C.psittaci.... 122-136
3.4. Изучение патогенности штаммов К-1 и С-1........ 137-150
3.5. Изучение длительности хранения хламидийного штамма К-1.......................................... 151 -155
3.6. Изучение чувствительности куриных эмбрионов различного возраста к штаммам К-1 и С-1...,............ 156-158
3.7. Выращивание возбудителя хламидиоза в клеточных культурах........................................... 159-161
3.8. Получение, характеристика и применение моноклональных антител к C.psittaci........................ 162-172
3.9. Характеристика гибридомы Хла-К-1-ДЕП........... 173-181
3.10. Технологический процесс получения диагностического препарата для выявления антигенов хламидий у животных методом прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) 182-201
3.11. Сравнение чувствительности и специфичности экспериментального диагностикума на основе флюоресцирующих моноклональных антител с зарубежными и отечественными аналогами................................. 202-217
ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ХЛАМИДИОЗА И ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИДОВ C.PSITTACI И C.PECORUM.............................. 218-250
4.1. Детектирование и видовая дифференциация хламидий методом ПЦР.................................... 218-223
4.2. Выбор методики выделения ДНК.................. 224-227
4.3. Определение аналитической специфичности и чувствительности ПЦР.................................... 228-234
4.4. Внутривидовая дифференциация штаммов C.psittaci методом рестрикционного анализа.................... 235-244
4.5. Сравнительная оценка методов лабораторной диагностики офтальмохламидиоза у кошек................... 245-250
ЗАКЛЮЧЕНИЕ......................................... 251-274
ВЫВОДЫ............................................. 275-277
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ........................... 278-280
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ................... 281-322
ПРИЛОЖЕНИЕ......................................... 323-351
33
ингибируют связывание ССА с HeLa-клетками, что свидетельствует об их конкуренции за общие структуры на мембране клетки-хозяина.
Выявлена плазмидонаправленная экспрессия белков массой 18, 28 и 82 kDa, которые предположительно опосредуют адгезию рекомбинантных клонов к клеткам МсСоу и эпителиальным клеткам эндометрия человека (306). Специфичность адгезии клонов, содержащих эти белки, соответствовала элементарным тельцам C.trachomatis. В настоящее время идентифицированы предполагаемые клеточные рецепторы, облегчающие адгезию хламидий (208). Специфическим высокоаффинным липидным рецептором клеток HeLa 229 для C.trachomatis и C.pneumoniae является фосфатидилэтаноламин. Хламидии довольно хорошо связываются с очищенным асиало-ганглиозидом-GM и асиало-GM, но не взаимодействуют с другими нейтральными или кислыми липидами.
Стресс-белки хламидий обладают жизненно важными функциями, участвуя в укладке, транспорте и сборке белков. Идентифицирован белок массой 57 kDa, не входящий в число липополисахаридов хламидий, который вызывает гиперчувствительный ответ конъюнктивы; он был индуцирован экстрактом элементарных телец C.trachomatis и C.psittaci после сенсибилизации штаммом конъюнктивита морских свинок C.psittaci (242). Этот родоспецифичный белок (hsp60) кодируется либо локусом hypB, либо локусом groEL соответственно оперонов hyp или groE хламидий, входит в семейство белков теплового шока, или стресс-белков, и
34
является одним из наиболее консервативных белков (113; 197; 241).
У всех видов хламидий белок hsp60 имеет четыре консервативных остатка цистеина, которые отсутствуют у других гомологов, детерминируемых локусом groEL. Посредством дисульфидных связей этот белок сцеплен с наружной мембраной элементарных телец и остается ассоциированным с ней при восстановлении. Вероятно, белок hsp60 участвует в перестройке наружной мембраны хламидий при переходе от элементарных к ретикулярным тельцам (113). Было обнаружено три типа апй-ИврбО-иммунореактивности моноклональных антител: видо- и родоспецифическая для хламидий, а также перекрестнореагирующая с другими бактериями (124; 370). Большинство моноклональных антител локализовано или на N- или на С-конце белка hsp60.
Белки, связанные с циклом развития. Морфологические изменения в течение цикла развития хламидий были детально изучены, но наше представление о молекулярных механизмах, управляющих этими процессами, до настоящего времени остается неполным. В штаммах клеток мыши и серовара L2 C.trachomatis идентифицирован ген sigA, кодирующий белок массой 67 kDa - предполагаемый гомолог белков sigma-70 и sigma-43, являющихся субъединицами РНК-полимераз соответственно E.coli и B.subtilis (133; 199). Четыре области этого sigma-полипептида были на 92% идентичны белку sigma-70 E.coli, тогда как другие значительно отличались.
Опероны 16S и 23S рРНК, транскрипция которых происходит на протяжении всего цикла развития хламидий,
- Київ+380960830922