2
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ...................................................... 4
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...............................................10
1.1 Краткая характеристика возбудителя...........................10
1.2 Молекулярная биология пестивирусов...........................10
1.3 Ущерб наносимый животноводству, патологии вызываемые вирусом.........................................................14
1.3.1 Эпизоотология..............................................14
1.3.2 Г1невмопато1енность.......................................................................... 17
1.3.3 Патология репродукции......................................18
1.3.4 Иммунные и иммунопатологические изменения вызываемые вирусом...................... ..................................19
1.4 Диагностика..................................................22
1.4.1 Основные методы диагностики.................................22
1.4.2 Выделение вируса на культуре клеток.........................23
1.4.3 Антигенная вариабельность вируса, проблемы
серологической диагностики........................................23
1.4.4 Методы генодиагностики......................................26
1.4.4.1 Реакции ОТ-ПЦР...........................................26
1.3.4.2 Молекулярная гибридизация.................................28
1.5 Заключение по обзору литературы...............................32
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ......................................33
2.1 Материалы и методы исследования...............................33
2.2 Разработка ОТ-11ЦР и ДНК-зонда................................40
2.2.1 Разработка ОТ-П1 [Р для синтеза ДНК-зонда...................40
2.2.2. Поиск, оптимального для использования в качестве ДНК-зонда, фрагмента генома вируса вирусной диареи...........................45
з
2.2.3 Испытание ОТ-ПЦР и отладка режимов......................51
2.3 Синтез и испытание ДНК зонда в лабораторных условиях......53
2.3.1 Синтез кДПК........................................... 53
2.3.2 Наработка ДНК зонда и мечение биотином..................54
2.3.3 Контроль технологии получения зонда.....................54
2.3.4 Изучение чувствительности и специфичности ДНК-зонда.....55
2.4 Изучение возможностей использования ДНК-зонда в сочетании с иммунологическим и серологическим методами для решения проблем диагностики вирусной диареи....................................60
2.4.1 Вариабельность титров антител к вирусу вирусной диареи среди свиней и крупного рогатого скота Новосибирской области.........60
2.4.2 Изучение иммуноморфологических изменений селезенки у' животных с различными титрами вируснейтрализующих антител.................62
2.4.3 Анализ проб селезенок с различными иммуноморфологическими характеристиками полученных от серопозитивных и серонегативных бычков методом молекулярной гибридизации..............................65
3. ОБСУЖДЕНИИ.................................................68
4. ВЫВОДЫ.....................................................87
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ...................................88
6. ЛИТЕРАТУРА.................................................89
7. ПРИЛОЖЕНИЯ.................................................109
10
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Краткая характеристика возбудителя.
Ранее пестивирусы относили к семейству Togaviridae однако последние данные об их молекулярной структуре, стратегии репликации и последовательности генов свидетельствуют о фундаментальных различиях на основе которых их выделили в отдельный род Peslivirus в семействе Flaviviridae (Dufell S.J., Harkness J.W. 1985).
Вирус вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота (ВД-ЬС, BVDV) - РНК-овый вирус, способный оказывать многообразное действие на организм животных. Внимание исследователей и практических ветеринарных врачей привлекают следующие патогенные свойства вируса:
1. Способность вызывать диарею и бронхопневмонию у молодняка крупного рогатого скота.
2. Нарушения репродуктивной функции - аборты, эндометриты, бесплодие.
3. Иммунодспрессивныс свойства вируса и, соответственно, усугубление тяжести течения других инфекционных зболеваний.
Другим немаловажным фактором, является широкое распространение инфекции как в нашей стране, гак и за рубежом.
1.2 Молекулярная биология пестивирусов
В последние годы с помощью современных методов исследования изучены молекулярные характеристики двух представителей рода Pcstivirus: вирус ВД КРС и КЧС. Этому способствовала разработка эффективной системы для размножения пестивирусов особенно КЧС (Giy A., Muylekermans G., De Smet A., et al. 1993.)
Первые исследования по изучению структуры генома были направлены на получение, идентификацию и характеризацию вирусной нуклеиновой кислоты. Было установлено, что геном пестивирусов представлен однонитчатой,
11
инфекционной РНК с коэффициентом седиментации равным 40-45S. Электрофоретический анализ вирусспецифичсских РНК в денатурирующих условиях позволил идентифицировать размер геномной РНК пестивирусов,равный
12,5 т.п.о. (Collet M.S., Mocnning V et al.,1989,) В отличие от тогавирусов, в клетках инфицированных вирусами КЧС и ВД КРС, не обнаружены субгеномные РНК. Кроме того, геномы пестивирусных РНК не содержат на 3"концах поли А-последовательностей (Moormann R., Warmerdam P., 1990.) Характеристика
вирусного генома на нуклеотидном уровне стала предпосылкой детального изучения структурной организации генома и кодируемых вирусом белков. После препаративного выделения вирионной РНК , синтеза кДНК и клонирования в плазмидных векгорах были секвснированы полные геномы ВД КРС -штаммы Singer, NADL, Osloss. (Collet M.S., Mocnning V et al.l 989). Геном пестивируса состоит из положительной нсполиаденилированной моллекулы РНК приблизительно 12,3 ко, которая содержит одину рамку считывания фланкируемую 5 и 3 некодируемыми регионами (NCR) (Becher et al 1998a, Colett et al 1988). В вирусном полипротеине, вирусные протеины разделяются на следующие (от С к N концу):N pro, С, Ems, El, Е2, р7, NS 2-3, (NS2), (NS3), NS4A, NS4B, NS5А и NS5B (обзор Meyers and Thill 1996). Аббревиатура N pro образованна от N-терминалъной ау-топротеазы; и Е ms (рибонуклеаза растворимая) представляет структурный гликопротеид с рибонукпеазной активностью.
Структурные белки представлены капсидным протеином С и 3-мя покровными белками (Ems, El и Е2). Оставшиеся белки предположительно не структурные (NS).
Различные участки пестивирусных геномов явились объектом для изучения их генетических различий, включая различные части 5NCR также как гены кодирующие С, Е2, Npro и др. неструктурные белки. 4 вида пестивирусов BVDV-1, BVDV-2, BDV и CSFV могли быть дифференцированы сравнением полных последовательностей генов (Becher et al. 1998а) и частичным секвенированием
- Київ+380960830922