СОДЕРЖАНИЕ
Обозначения и сокращения 4
Введение 8
Глава 1 Аналитические системы на основе микрофлюидных устройств 20
1.1 Микроаналитические системы и микрофлюидные устройства ~(1
1.2 Микрофлюидная платформа. Классификация, состав, основные элементы микрофлюидных устройств 3
1.3 Моделирование в микрофлюидике ^
30
1.4 Материалы и методы изготовление микрофлюидных устройств
30
1.4.1 Материалы для микрофлюидных устройств
1.4.2 Методы и способы изготовления микрофлюидных устройств 1
1.5 Наноразмерные структуры в микрофлюидньїх устройствах
1.6 Разделение компонентов пробы в микрофлюидных устройствах
1.6.1 Выделение и разделение частиц в микрофлюидных устройствах ^
1.6.2 Микрофлюидные устройства для разделения и анализа
СЗ
нуклеиновых кислот и белков 33
1.7 Микрочиповые устройства для полимеразной цепной реакции
1.8 Детектирование в микрофлюидных устройствах ^1
1.9 Коммерциализация микрофлюидных устройств и приборов для исследований биологических проб ^2
Выводы к Главе I ^
Глава 2 Теоретические основы создания аналитических систем на базе микрофлюидной платформы и оптических методов детектирования 69
2.1 Микрофлюидные устройства для электрофоретического анализа 76
2.1.1 Электроосмотический поток и электрофоретическое разделение пробы в микрофлюидном устройстве 77
2.1.2 Инжекция пробы в микроканал 94
2.2 Оптическое детектирование в микрофлюидных устройствах ЮЗ
2.2.1 Детектирование флуоресценции 104
2.2.2 Особенности флуоресцентного детектирования в МФЧ 109
2.3 Методы и способы фиксации биологических объектов для
2
микроскопии высокого разрешения
2.3.1 Способы фиксации и удержания биологических объектов в микрофлюидных устройствах
2.3.2 Фиксация и удерживание микрообъектов в гидродинамических (механических) ловушках
2.3.3 Особенности диэлектрофоретического метода фиксации и удерживания биологических объектов
Выводы к Главе 2
Глава 3 Экспериментальные исследования. Методы и способы изготовления микрофлюидных чипов
3.1 Химические, теплофизические и оптические свойства стеклянных материалов для МФЧ
3.2 Формирование микро- и наноразмерных структур в стеклянных подложках
3.2.1 Формирование микроструктур методами фотолитографии и кислотное травления стекла
3.2.2 Формирование наноразмерных каналов и пор в стеклянной подложке техникой сфокусированного ионного пучка
3.3 Герметизация микрофлюидных чипов
3.3.1 Герметизация стеклянных микрочипов методом термического связывания
3.3.2 Герметизация микрочипов полимерными материалами
3.4 Формирование микроструктур в полимерных материалах
3.4.1 Метод лазерной абляции при формировании микроразмерных структур
3.4.2 Формирование микроразмерных структур в полиметилметакрилате
3.4.3 Герметизация микрочипов из полиметилметакрилата
3.4.4 Формирование микроразмерных структур в поликарбонате
3.4.5 Формирование каналов в полиимидных пленках
Выводы к Главе 3
Глава 4 Аналитические системы и приборы на основе микрофлюидных чипов
4.1 Аналитическая система для электрофоретических методов исследования проб
4.1.1 Микрофлюидные чипы для электрофоретических методов исследования
3
114
115
116
122
126
129
130
139
140
148
154
156
167
176
180
186
193
197
202
206
208
208
208
4.1.2 Аналитическая система с детектором лазер-индуцированной флуоресценции для электрофоретических методов анализа на МФЧ
4.1.3 Основные правила работы с МФЧ для электрофореза: подготовка, эксплуатация и хранение
4.2 Приборы и микрочипы для проведения ПЦР
4.3 Экспериментальная установка для исследований микрообъектов на основе оптического инвертированного микроскопа и микрофлюидной платформы
4.3.1 Микрофлюидные чипы с гидродинамическими ловушками
4.3.2 Микрофлюидный чип для диэлектрофореза Выводы к Главе 4
Глава 5 Экспериментальные исследования наноразмерных структур
5.1 Массив полупроводниковых нитевидных нанокристаллов GaAs
5.1.1 Оптические свойства массива ННК
5.1.2 Воздействие лазерного излучения на массив НИК
5.1.3 Образование пространственных регулярных структур в массиве ННК
Выводы к разделу 5.1
5.2 Пористые стекла, как функциональные элементы микрофлюидных устройств
5.2.1 Оптические свойства пористых стекол
5.2.2 Исследование пористых стекол методами конфокальной лазерной микроскопии и оптической микроскопии ближнего
ПОЛЯ
5.2.3 Пористые стекла как основа для создания оптических чувствительных элементов
Выводы к разделу 5.2
Глава 6 Экспериментальные исследования. Анализ биологических проб на микрофлюидном чипе
6.1 Электрофоретическое разделение биологических проб на микрофлюидном чипе
6.1.1 Экспресс-анализ полинуклеотидов
6.1.2 Разделение фрагментов Д1IK
6.1.3 Иммунный анализ инсулина
220
233
235
239
241
242 244
246
246
247 250
252
254
255
256
264
275
282
284
284
284
288
293
300
4
6.1.4 Определение меченного сульфадиазина 303
6.1.5 Разделение аминокислот 308
6.2 ПЦР в реальном времени на микрофлюидном чипе 311 Выводы к Главе 6
Глава 7 Экспериментальные исследования микрофлюидных чипов для диэлектрофореза и микрочипов с
гидродинамической ловушкой 314
6.3 Удерживание микрочастиц в чипе для диэлектрофореза 314
6.4Фиксация микрочастиц в гидродинамических ловушках 316
Выводы к Главе 7 320
Заключение 321
Список использованных источников 324
5
Обозначения и сокращения
АК - аминокислота
АСМ - атомно-силовая микроскопия
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
ГОК - глубокий оптический контакт
ГРИТ - глубокое реактивное ионное травление
ДДСН - додецилсульфат
ДЭ - диэлектрофорез
ДЭС - двойной электрический слой
ЗЭ - зонный электрофорез
КГЭ - капиллярный гель-элсктрофорез
КЗЭ - капиллярный зонный электрофорез
КЛСМ - конфокальный лазерный сканирующий микроскоп
КТ - квантовая точка
КЗ - капиллярный электрофорез
ЛА - лазерная абляция
ЛИФ - лазер-индуцированная флуоресценция
МБАП - микрофлюидный бумажный аналитический прибор
МС - масс-спектрометрия
МПЗ - молекулярно - пучковая эпитаксия
МФП - микрофлюидная платформа
МФЧ - микрофлюидный чип
МФАС - микрофлюидная аналитическая система
МФУ - микрофлюидное устройство
МЭМС - микро-электромеханичсская система
б
НИЛ - наноимпринтинговая литография ННК - нитевидные нанокристаллы ОТ - обратная транскриитаза ПДМАА - пол иди метил акриламид ГТДМС - полидиметилсилоксан ПИ - полиимид
ПММА - полиметилметакрилат
ПК - поликарбонат
ГІО - программное обеспечение
ПС - пористое стекло
ПСМ - поперечно - силовая микроскопия
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РИТ - реактивное ионное травление
СИП - сфокусированный ионный пучок
СЗМ - сканирующая зондовая микроскопия
цШ \Р - цифровая ПІJP
ФЭУ - фотоэлектронный умножитель
ЭЛ - электронная литоірафия
ЭЛЛ - электронно-лучевая литография
ЭМФЧ - электрофорез на микрофлюидном чипе
ЭОП - элекгроосмотический поток
FITC - fluorescein isothiocyanate (флуоресцеин-изотиоцианат) SDZ - сульфадиазин
7
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. Развитие и доступность технологий микроэлектроники привело к появлению аналитических систем на основе микрофлюидных устройств (МФУ), позволяющих осуществлять уникальные манипуляции с микроколичествами жидкой или газообразной пробы. Такие системы получили название «лаборатория на чипе» (lab on a chip). Объединение всех стадий и этапов аналитического определения в одном компактном устройстве дает возможность проводить анализ пробы в микроформате с высокой чувствительностью, точностью и экспрессностыо определения компонентов.
Современными тенденциями развития МФУ являются: а) миниатюризация; б) интеграция в устройства новых функциональных модулей; в) увеличение числа измерительных каналов; г) применение наноразмерных элементов и систем; д) управление и контроль за всеми стадиями анализа; е) увеличение информативности измерений.
Создание аналитической системы на МФУ связано с решением ряда научных, методических, технических и технологических задач. Анализируемый компонент пробы и метод его анализа (или способ обнаружения) определяют топологию и конструкцию устройства, ассортимент применяемых материалов, технологии изготовления устройства, методы детектирования. Только комплексный подход, увязывающий выбор материалов, конструирование, технологии изготовления, интеграцию новых элементов и систем, внедрение новых принципов управления движением и разделением анализируемых компонентов пробы дает возможность создавать современные приборы на МФУ. Известные зарубежные конструкции МФУ защищены патентами и режимами коммерческой тайны (know-how). Поэтому требуется проведение собственных исследований и разработок, которые позволят создавать аналитические системы на основе МФУ.
8
Наиболее востребованными при исследованиях многокомпонентных биологических проб являются электрофоретические методы анализа. При разнообразии конфигураций (конструкций) МФУ, применяемых для электрофоретических методов, существуют общие требования к этим устройствам. Поэтому перспективной является разработка универсальной и простой топологии, которая могла бы использоваться для решения различных исследовательских задач.
Применение оптически прозрачных материалов (стекол, полимеров) в микрогидродинамике (микрофлюидике) дает возможность использовать высокочувствительные оптические методы детектирования компонентов пробы. Востребованными являются исследования по изучению возможности применения отечественных марок стекол для МФУ, адаптация технологий микроизготовления и способов герметизации для этих материалов, изучение влияния различных факторов на свойства и характеристики устройств. В качестве альтернативных, относительно дешевых материалов могут применяться полимеры (поликарбонат, полиметилметакрилат, полиимид и др.). В этой связи важной задачей является исследование режимов воспроизводимого формирования микроразмерных структур с заданными характеристиками в полимерных материалах при использовании коммерческих технологических установок.
Интеграция в МФУ новых функциональных микро- и наноразмерных элементов и систем (микро- и наноэлектродов, наноразмерных каналов, массивов нанопроволок, нанопористых сред и т.д.) является перспективным направлением совершенствования устройств, так как дает возможность значительно расширить круг решаемых задач за счет использования новых физических принципов и методик анализа, улучшить аналитические характеристики устройств. Все это требует проведения комплексных исследований по изучению способов создания наноразмерных элементов, их характеристик, взаимодействия наноструктур с жидкими средами, определению возможностей детектирования анализа.
9
Внедрение МФУ в практику лабораторных исследований все еще ограничено, так как рынок оснащен альтернативными аналитическими системами и приборами. Только немногие фирмы производят коммерческие аналитические системы на МФУ, среди них: Agilent Technologies Inc., Caliper Technologies Inc., Bio-Rad, Shimadzu Corp. и др. Разработка и создание отечественной приборной базы на основе МФУ позволила бы отказаться от импорта дорогостоящего оборудования и создать системы с техническими характеристиками, не уступающими лучшим зарубежным образцам.
Вышеизложенное определяет актуальность данного направления исследований, развивающего комплексный подход к созданию аналитических систем на основе МФУ и оптических методов детектирования.
Нель работы: создание микрофлюидных устройств для исследований биологических проб методами флуоромегрии и оптической микроскопии высокого разрешения.
Для достижения поставленной цели решались следующие основные задачи:
1. Теоретические и экспериментальные исследования влияния геометрических и конструктивных параметров устройств, физикохимические свойств используемых материалов, технологий их обработки на характеристики МФУ;
2. Создание МФУ и приборно-аппаратных средств для электрофоретического разделения пробы, полимеразной цепной реакции (ПЦР);
3. Обоснование и реализация новых принципов исследований биологических проб на МФУ с применением микро- и наноразмерных структур (нанопористых стекол, массива нитевидных нанокристаллов -ИНК, наноразмерных каналов, микроэлектродов), как новых
ю
функциональных элементов МФУ (оптического сенсора, гидродинамических и диэлектрофорстических ловушек);
4. Апробация актуальных методик на МФУ: электрофоретического анализа пробы; ПЦР в реальном времени; изучения микрообъектов методами оптической микроскопии высокого разрешения.
Научная новизна диссертационной работы состоит в оригинальном методологическом подходе к проектированию приборно-аппаратных средств на основе МФУ, заключающемся в проведении комплексной системной разработки с учетом: специфики исследуемого объекта, методики анализа, применяемых материалов, технологий формирования микро- и наноструктур, конструктивных элементов устройства, физико-химических свойств поверхности функциональных элементов, метода детектирования. Все это позволяет расширить область функциональных возможностей МФУ улучшить аналитические характеристики создаваемых на их основе устройств.
В работе впервые:
1. Предложена и реализована новая универсальная топология микрофлюидного чипа (МФЧ), обеспечивающая возможность дозирования разных объемов пробы электрокинетическими и гидродинамическими способами.
2. Экспериментально установлено, что отражательные свойства массива ННК из СаАБ определяются формой вершины нанокристаллов. Обнаружено спектрально-сслективнос воздействие лазерного излучения на наноструктуры ОаДэ, приводящее к «слипанию» нанокристаллов и вызывающее изменение отражательной способности.
3. На примере обнаружения инсулина в пробе продемонстрирована возможность использования пористых стекол (в частности 8В-МАР), как основы нового оптического сенсорного элемента для регистрации конкурентной иммунной реакции.
11
4. Экспериментальные и теоретические исследования позволили получить ряд оригинальных результатов по оценке влияния конструкционных, технологических, методических факторов при применении МФУ для анализа биологических проб, которые позволяют создать основу для решения задач оптимизации топологий или/и режимов анализа (управления).
Практическое значение работы определяется
1. Разработанными и созданными макетными образцами аналитических систем на МФУ с флуоресцентными детекторами, которые используются в ИЛП РАН при проведении научно-исследовательских работ.
2. Изготовленными стеклянными МФЧ, предназначенными для электрофоретических и диэлектрофоретических методов исследований биологических проб, а также для методов ПЦР (за последние пять лет совместно с ЗАО «Светлана-полупроводники», г. Санкт-Петербург создано более 250 штук).
3. Отработанными режимами формирования микроразмерных структур в поли метил метакрилате методом лазерной абляции (ЛА) и полученными экспериментальными образцами МФЧ для электрофоретического разделения пробы (совместно с ООО «Лазерный центр», г. Санкт-Петербург).
4. Обнаруженным эффектом спектрально-селективного воздействия лазерного излучения на массив ННК, пригодным для применения в новых технологиях обработки наноструктур и при изготовлении конструкций МФЧ с наноразмерными функциональными элементами.
5. Внедрением результатов работы в учебный процесс в форме авторских курсов лекций для бакалавров и магистров: «Микро- и нано- технологии в биологических и медицинских исследованиях» в СПб АУ НОЦ НТ РАН, «Микро- и наноаналитичсские методы исследования жидких сред», «Биоаналитические системы на основе микрочиповых технологий» в НИУ ИТМО.
12
Положения, выносимые на защиту
1. Конфигурации МФЧ и аналитических систем, содержащие новые технические решения: МФЧ с универсальной топологией для электрофоретического разделения пробы, с гидродинамическими ловушками и флуорометрические системы детектирования.
2. Экспериментальные результаты разделения и анализа биологических проб (в частности, фрагментов ДНК) на МФЧ, подтверждающие достижение аналитических характеристик, превосходящих соответствующие макроаналоги: уменьшения объема анализируемой пробы (в 2-5 раз) и времени определения (~ в 10 раз) при сопоставимом пределе обнаружения и динамическом диапазоне.
3. Новые эффекты, выявленные при экспериментальных исследованиях взаимодействия электромагнитного излучения с массивом ННК (зависимость отражательной способности массива от формы вершин кристаллов) и взаимодействия молекул флуорофора с ННК (образование пространственных регулярных структур), их интерпретация и применение в устройствах на основе МФУ.
4. Результаты экспериментальных исследований, подтверждающие возможность использования пористых стекол, как основы оптического сенсорного элемента в МФЧ для регистрации конкурентной иммунной реакции на примере обнаружения инсулина в пробе.
5. Результаты экспериментальных измерений рельефа поверхности структур при кислотном травлении и термической обработке стекла, полученные при исследовании технологий изготовления микроструктур в стеклянных материалах, и оценка их влияния на характеристики МФЧ.
6. Результаты экспериментальных исследований по выбору режимов ЛА для формирования микроразмерных каналов заданной геометрии (шириной от 30 до 300 мкм и аспектным отношением <1) в полимерных материалах.
7. Способы управления движением и фиксацией микрочастиц размером от 1 до 6 мкм на МФЧ с микро- и наноструктурами для последующей их
визуализации методами конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и их практическая реализация.
Личный вклад автора
Автор является одним из инициаторов работ по созданию и развитию МФУ и приборов на их основе для анализа биологических проб. Вклад автора состоит в формировании направления исследований, постановке цели и задач, разработке приборов и устройств, проведении экспериментальных, технологических и методических работ, интерпретации полученных результатов. Все экспериментальные результаты, представленные в работе, их обработка и анализ получены непосредственно при участии автора. Диссертация представляет собой обобщение материалов исследований и разработок, выполненных автором лично, с сотрудниками лаборатории, с коллегами из СПб АУ ПОД НТ РАН (д. физ-мат. наук Г.Э. Цырлин), ИХС РАН (д. хим. наук Т.В. Антропова), ФТИ РАН, НИУ ИТМО, ЗАО «Светлана-полупроводники», ООО «Лазерный центр». В работах, опубликованных в соавторстве, автору принадлежат результаты, сформулированные в защищаемых положениях и выводах.
Связь с государственными программами и МНР
Тематика исследований поддержана:
Межведомственной научно-технической программой “Вакцины нового поколения и диагностические системы будущего” проекты «Микроаналитические системы: портативные и лабораторные экспресс-анализаторы и биосенсоры на основе чип-реализации одноканального и мультиканального приборов капиллярного электрофореза» (2000-2001 гг.) и «Новые принципы детекции и разработка на их основе приборов для автоматизации лабораторно-диагностических методов исследования» (2002-2006 гг.);
Научными Программами СПб НЦ РАН, проекты «Микрофлюидные чип-анализаторы» (2001 г.), «Аналитические приборы на основе микрофлюидных
14
технологий» (2003 г.); «Микрофлюидные чип-анализаторы с
интегрированными наноструктурами (нановискерами)» (совместно с лаб. д. физ-мат. наук Г.Э. Цырлина, 2005-2006 гг.), «Микрофлюидные
аналитические системы с интегрированными наноструктурами (пористыми стеклами)» (совместно с ИХС РАН, 2009г.);
Грантом РФФИ-ГФЕН 03-01-39003_а «Теоретические и экспериментальные исследования явлений переноса и взаимодействия биологических объектов в микрофлюидных устройствах» (2004-2005гг);
Грантом РФФИ 05-02-08090 офи а “Микроаналитические системы с интегрированными нитевидными кристаллическими нанострукту-рами” (совместно с лаб. д. физ-мат. наук Г.Э. Цырлина, 2005-2006 гг.);
Программой фундаментальных исследований ОХМН РАН «Создание и совершенствование методов химического анализа и исследования структуры веществ и материалов», проекты «Создание наноструктурных пористых элементов функционального назначения для микроаналитических систем» (совместно с ИХС РАН, 2006-2008гг.), «Микрофлюидные чипы для анализа биополимеров» (2010-2011 гг.);
Аналитической ведомственной целевой программой "Развитие научного потенциала высшей школы" проект «Исследования и диагностика клеточных структур: новые методические подходы и инструментальные решения на основе сканирующей зоидовой микроскопии и микрочиповых технологий» (1ГИУ ИТМО, 2009-2011 гг.)
Апробация работы
Основная часть разработок и результатов исследований, изложенных в
диссертации, докладывалась и обсуждалась на Всероссийских и
международных конференциях и симпозиумах: SPIE Conference BiOS 2002
(San Jose, USA, 2002); 1-ой Всероссийской конференции «Аналитические
приборы» (Санкт-Петербург, Россия, 2002 г); Всероссийской конференции
«Актуальные проблемы аналитической химии» (Москва, Россия, 2002 г); 14-
th International Symposium Boron, Borides and Related Compounds (St
15
Petersburg, Russia, 09-14 June 2002); XIV и XVI Российских конференциях по использованию синхротронного излучения (Новосибирск, 2002, 2006 гг); 3rd Int. Symposium on Separations in BioSciencies SBS-2003 (Moscow, Russia, 2003); Международном Форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, Россия, 2003 г); Seventh, Bight, Night Seminars on Porous Glasses-Special Glasses (PGL’2005, 2007, 2009, Szklarska Por^ba, Poland); 2-ой Международной научно-практической конференции «Исследования, разработки и применение высоких технологий в промышленности» (Санкт-Петербург, Россия, 2006 г); XIV Int. Symposium «Nanostructure: Phys&Techn» (Репино, Россия, 2006 г); European conference on surface science ECOSS 24 (Paris, 2006); Сессии Научного совета РАН по аналитической химии. Школа-конференция «Успехи аналитической химии» (Звенигород, 2006 г); XVIII и XIX Менделеевских съездах по общей и прикладной химии (Москва, 2007 г, Волгоград, 2011 г); VIII и IX Международных конференциях «Прикладная оптика» (Санкт-Петербург, 2008, 2009 гг); XX Симпозиуме «Современная химическая физика» (Туапсе, 2008 г); III Russian Conference on Nanomaterials “NANO-2009” (Ural, Ekaterinburg, 2009); Spring Meeting European Materials Research Society (EMRS Spring-2011, Nice, France, 2011); International Conference on Materials for Advanced Technologies (ICMAT 2011, Singapore, 2011); Lab-on-a-Chip European Congress (Hamburg, Germany, 2011); семинарах по микрочиповым технологиям, организованных в МГУ (Химический факультет) и Институте аналитического приборостроения РАН.
Публикации
Основные результаты работы представлены в 105 научных трудах, в том числе 45 работ опубликовано в рецензируемых отечественных и зарубежных научных изданиях, рекомендованных ВАК для защиты докторских диссертаций.
16
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, семи глав, заключения, списка литературы из 551 наименования. Текст диссертации изложен на 353 стр., включая 104 рисунка и 9 таблиц.
Первая глава представляет собой аналитический обзор исследований и разработок приборов на основе МФУ, основных терминов и определений. В заключительной части сформулированы основные задачи диссертационной работы.
Вторая глава состоит из грех разделов и в ней рассмотрены основы создания аналитических систем на МФУ с оптическими методами детектирования. В разделе 2.1 проанализированы процессы и явления наиболее существенные при реализации методов капиллярного электрофореза на МФУ, в частности, капиллярного зонного электрофореза и капиллярного гель-электрофореза. Представлен сравнительный анализ вариантов (способов и топологий) используемых при инжекции пробы в канал МФУ, на основании которого разработана универсальная конструкция, обеспечивающая инжекцию пробы различных объемов в сепарационный канал двумя способами - электрокинетическим и гидродинамическим. В разделе 2.2 анализируются особенности расчета флуоресцентного детектора для МФУ. Приведены рекомендация, позволяющие улучшить аналитические характеристики детектора для регистрации флюоресценции в МФУ. В разделе 2.3 изложены методы и способы фиксации биологических объектов в МФУ. Показано, что наиболее простыми устройствами, реализуемыми в МФУ, являются механические и гидродинамические ловушки с микро- и наноструктурами, а также планарные электроды для диэлектрофореза (ДЭ).
Третья глава диссертации посвящена экспериментальным исследованиям способов формирования микро- и наноразмерных структур в стеклянных и полимерных материалах, процессов герметизации при изготовлении МФЧ. В разделе 3.1 проводится анализ химических, теплофизических и оптических свойств стекол К8 и Ф1, с целью выявления
17
их пригодности для использования в МФУ, исходя из требований: химической стойкости, оптической прозрачности, низкой фоновой флуоресценции. В разделе 3.2 рассмотрены методы фотолитографии и кислотного травления стекла, а также техника сфокусированного ионного потока при получении микро- и нано- размерных структур в стекле К8 для микрофлюидного устройства. Раздел 3.3 посвящен методам и способам герметизации МФЧ. Особое внимание уделяется методу термического связывания стекол и соединению с помощью полимерных композиций. В разделе 3.4 приведены результаты исследований возможности применения метода ЛА для получения микроразмерных структур с воспроизводимыми характеристиками в полимерных материалах (полиметилметакрилат, поликарбонат, полиимид).
Четвертая глава состоит из трех разделов. В первом разделе рассматриваются конструкции МФУ для анализа биологических проб методами электрофореза и аналитические системы с флуоресцентным детектированием компонентов пробы. Отдельный раздел посвящен микрочипам для молекулярной диагностики проб на основе методов ПЦР и флуоресцентного детектирования. Особое внимание уделено разработанным конструкциям МФЧ для исследований биологических объектов методами микроскопии высокого разрешения.
В пятой главе приведены результаты экспериментальных исследований наноразмерных структур, перспективных для применения в МФУ: полупроводниковых кристаллических наноструктур и пористых стекол. В разделе 5.1 рассматривается возможность использования ННК в МФЧ как элементов оптического биосенсора, что являлось мотивацией изучения спектральных зависимостей отражательной способности массива ННК и влияния на них лазерного излучения. Раздел 5.2 посвящен изучению применения пористых стекол в качестве функциональных элементов МФУ, в частности - оптических сенсорных элементов, что обусловило необходимость исследования спектральных свойств ПС.
18
В шестой главе приведены результаты апробации разработанного комплекса приборов при анализе биологических проб на МФЧ. Раздел 6.1 посвящен реализации методов электрофоретического анализа биологических проб (полинуклеотидов и фрагментов ДНК) на МФЧ,. Показана возможность электрофоретического разделения иммунного комплекса и свободного антигена (на примере инсулина) на МФЧ. В Разделе 6.2 приведены результаты исследований, связанных с постановкой жидкостной ПЦР в реальном времени на МФЧ. Исследованы способы очистки и регенерации стеклянного МФЧ после проведения ПЦР.
В седьмой главе приводятся результаты экспериментальных исследований на МФЧ с гидродинамическими наноразмерными ловушками и с диэлектрофоретической системой фиксации и удерживания частиц для методов оптической микроскопии, в том числе конфокальной лазерной микроскопии.
В заключении представлены основные результаты работы и выводы.
19
ГЛЛВЛ 1 АНАЛИТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ МИКРОФЛЮИДНЫХ УСТРОЙСТВ
1.1 Микроаналитические системы и микрофлюидные устройства
Микроаналитические устройства появились как системы, основанные на достижениях микроэлектронной промышленности, аналитической химии и других наукоемких технологий. Первое микроаналитическое устройство -газовый хроматограф на кремниевой пластине был создан в 1975 г в Стэнфордском университете С. Терри и его коллегами [1] с применением технологий микроэлектроники. Спустя почти пятнадцать лет была изготовлена микроколонка для высокоэффективной жидкостной хроматографии на основе кремний-стеклянного (Si-Pyrex) микрочипа [2]. В конце 1980-ых годов, А. Манцем (A. Manz) была предложена концепция создания аналитических систем на микрочиповой платформе [3]. Первоначально предполагалось применение методов фотолитографии и химической обработки материала с целью получения микроаналитической системы на единой подложке, позволяющей проводить подготовку пробы, осуществлять химические реакции, электрофоретическое разделение и детектирование пиколитровых объемов пробы. Исследовательские группы А. Манца и Д. Гаррисона (D. J. Garrison) продемонстрировали микрофлюидное устройство из стеклянных материалов для быстрого электрофоретического разделения пробы [4, 5]. Аналитические системы на основе микрофлюидных чипов (МФЧ) за рубежом получили названия «lab on a chip» (лаборатория на чипе) и «micro Total Analysis Systems» (микросистемы «полного» анализа) [6].
Появление микрофлюидики (микрогидродинамики), как отдельного научною направления, изучающего поведение жидкостей (и газов) на уровне микромегровых размеров, также следует отнести к 1990-ым годам, когда доступными для исследователей стали методы микроизготовления устройств. Увеличилось число статей, посвященных разработке аналитических систем на микрочиповой платформе, изучению процессов и явлений в микро- и
20
наноразмерном масштабе, созданию новых методов синтеза и анализа веществ на микрочипах, исследованию возможностей микрофлюидики. Современным развитием микрофлюидики является нанофлюидика [7], изучающая эффекты в наноразмерных системах, транспорт молекул через наноканалы, взаимодействие частиц с наноструктурами и т.д.
Отметим особенности микро- и нанофлюидики, а именно:
□ большое соотношение поверхности к объему;
□ проявление явлений, не существенных в макро- гидродинамике;
□ соизмеримость размеров структур, в которых рассматриваются процессы и явления, с молекулами и частицами в этих структурах;
□ значительные величины флуктуаций плотности;
□ транспортные свойства (вязкость, диффузия, теплопроводность) могут определяться размерными факторами;
□ возможность нарушения приближения сплошной среды.
Развитие микрофлюидики привело к появлению приборов, в которых осуществлялось воспроизводимое управление нано- и пиколитровыми объемами жидкости [8]. Если в первых МФЧ реализовывались методики электрофоретического разделения, то впоследствии стали создаваться микрочипы и для других методов анализа, в частности для полимеразной цепной реакции (ГГЦР). Первыми работами в области создания систем для ПЦР на микрочиповой платформе являются работы Л. Криска (L. J. Kricka) [9-11J. А к пионерским работам по коммерческому использованию микрочиповых технологий для амплификации нуклеиновых кислот следует отнести работы А. Нортрапа (A. Northrup) с соавторами, в которых была показана возможность скоростной постановки ПЦР на микрочипе [12, 13]. В 1994 г. появились публикации М. Рамсея (J. М. Ramsey) и его коллег, развивающие методы электрофоретического и электрохро-матографического разделения проб на МФЧ [14-17].
Микрофлюидные устройства (МФУ) (или в планарном исполнении -микрофлюидные чипы - МФЧ) являются основой микроаналитической
21
системы. Чтобы обеспечить возможность проведения анализа пробы на МФУ требуется дополнительное приборно-методическое обеспечение:
- гидравлические и электрические интерфейсы;
- устройства детектирования;
- микропроцессорные устройства управления;
- источники питания;
- вспомогательные приспособления для МФУ;
- специализированные методики анализа;
- программное обеспечение;
- база данных.
В МФУ все аналитические стадии (загрузка пробы, транспортировка пробы и реагентов, фильтрация и концентрирование пробы, химические реакции, разделение продуктов, детектирование анализа и т.д.) можно проводить на одной, полностью автоматизированной платформе [18, 19]. Стоимость такой аналитической системы на настоящий момент времени является весьма высокой, поэтому для ее создания нужна веская мотивация. Одной из целей создания приборов для анализа биологических проб на основе МФУ - получение доступных и надежных систем диагностики, не требующих специальных условий эксплуатации и высокой квалификации персонала [20].
Достоинствами микрофлюидных систем, по мнению одного из
ведущих экспертов в этой области Г. Вайтсайда (G. Whitesides) [21],
являются: мобильность, износостойкость, высокая чувствительность, низкая
стоимость и малое время анализа, небольшие габариты и низкое
энергопотребление. Приборы на основе МФУ позволяют работать с
объемами анализируемых проб - до долей нанолитров (нл), имеют малый
расход реагентов и пробы, дают возможность встраивать микрочип в
существующие аналитические системы со сложной архитектурой.
За последние 10 лет по теме микрофлюидика (microfluidic) по данным
ISI Web of Science было издано более 10 тыс. статей. МФУ востребованы в
22
научной сфере и в промышленности, как новый многообещающий инструмент для развития и создания новых методов и продуктов. За рубежом по микроаналитическим системам и смежным направлениям издается значительное число монографий и книг [22-28].
Инициаторами работ но развитию микрофлюидных технологий в России стали академик Ю.А. Золотов [29] и профессор В.Г. Беленький [30-33]. Важную роль в развитии и популяризации этого направления сыграл Семинар по микрочиповым технологиям, организованный в Московском государственном университете (Химический факультет) и Институте аналитического приборостроения РАН. Отдельные материалы работы семинара опубликованы в журнале «Научное приборостроение». Состояние работ по развитию микрофлюидных аналитических систем в России в какой-то степени отражает недавно вышедшая монография «Микрофлюидные системы для химического анализа» [34].
1.2 Микрофлюидная платформа. Классификация, состав, основные
элементы микрофлюидных устройств
Авторы [35] вводят понятие микрофяюидиой платформы (МФП), как системы, изготовленной в рамках определенных технологий, в которой реализуются заданные (технологические, аналитические и др.) операции с жидкостью. Основными тенденциями развития приборов на МФП являются миниатюризация, интеграция, автоматизация и создание параллельных каналов измерений. Предлагается классифицировать МФП на пять групп в соответствии с доминирующими принципами движения под действием: капиллярных сил, сил давления, центробежных сил, электрокинетических и акустических сил.
В общем случае полный анализ биологической пробы включает стадии:
забора и переноса образца пробы, очистки и приготовления образца
(разделение и сортировка клеток; лизис клетки, если необходимо исследовать
отдельные компоненты), экстракции и очистки объекта анализа (например,
23
нуклеиновых кислот), амплификации, сепарации и детектирования [36]. На первой стадии анализа образец должен быть перенесен на МФУ через промежуточный интерфейс, приспособленный к конкретному типу образца (моча, слюна, кровь, ткань и т.д.), без существенных потерь и загрязнения образца или среды [37].
В соответствии со стадиями анализа в общем случае МФУ может содержать следующие функциональные элементы: гидравлические и
электрические интерфейсы; порты ввода пробы и реагентов; устройство подготовки пробы; устройство накопления (фильтрации, амплификации) аналита; дозирующие (инжекционные) устройства; систему разделения (сепарации) пробы; устройство детектирования и т.д. Конечно, наличие всех функциональных элементов не является обязательным - все зависит от конкретных решаемых задач. Топология (архитектура) и конструкция микрочипа для исследований биологических объектов определяется методами анализа и теми операциями, которые реализуются на чипе.
Во многих случаях анализируемая проба имеет сложный состав, например, для проведения анализа крови требуется осуществить многоэтапную пробоподготовку, отделить частицы, клетки или молекулы для последующего анализа. Наиболее простым методом разделения частиц в МФУ является дискриминация частиц по размерам, но при этом разделяемые частицы должны иметь различия в размерах, а для эффективного разделения требуется система фильтров [38].
В некоторых аналитических системах применяются МФУ, выполненные в виде диска (СП-чип) [39, 40], где центробежные силы вызывают движение потоков. Но для такого разделения частиц необходимы существенные отличия в их плотности. Для разделения частиц с близкими характеристиками используют другие техники [41-46]: диэлектрофорез [47-49], разделение в оптических полях (оптофорез, оптическая хроматография) [50, 51], магнитофорез [52, 53], разделение в акустических полях [54, 55] и Т.д.
24
В МФУ используются следующие способы управления микропотоками вещества: электрокинетический, гидростатический и гидродинамический. Наиболее технологичным и автоматизируемым считается электрокинетический, но его использование подразумевает необходимость выбора режимов управления, буферного раствора, контроля и учета возможных химических и электрохимических реакций [56, 57].
Электрокинетический ввод пробы обладает недостатками: в процессе ввода осуществляется частичная сепарация компонентов пробы и, при сравнительно длинных транспортных каналах, ввод может занимать много времени. Таким образом, для ускорения инжекции пробы и уменьшения влияния электрофореза должна быть выбрана минимальная длина подводящих каналов. Аналитические характеристики МФУ зависят от устройства инжекции пробы и стабильного потока в канале, поэтому значительное внимание уделяется исследованию способов дозирования и типов дозаторов [58].
Наиболее часто применяемые варианты дозирования и схемы инжекторов приведены в Таблице 1.1 [59]. При инжекции по схемам «Т» и «крест» удается достигнуть предельно малых объемов вводимой пробы - до нескольких пиколитров, при инжекции по схемам «П», двойного «Т» и двойного «креста» объем пробы может составлять сотни и тысячи пиколитров. Электрокинетический ввод пробы широко используется в МФУ еще и благодаря процедуре сжатия пробки пробы, позволяющей концентрировать пробу в десятки и сотни раз, что даю возможность значительно снизить порог обнаружения ряда веществ [60]. Недостатки электрокинетического инжектора привели к развитию альтернативных методов дозирования, обладающих более высокими скоростями ввода пробы, например, с системой давления и пассивным клапаном [61] или с применением высокого давления и инжектора на основе фотополимеризуемых фторсодержащих акрилатов [62]..
25
Таблица 1.1 - Топология инжекторов [59]
Топология V* Ч ( т і и д J II II
' ч \хґ 1 « JUL 1ПГ
Тип инжектора Т Двойной Т П Крест Двойной крест
Инжекция 2 стадии 2 стадии 2 или 3 стадии 2 или 3 стадии 2 стадии
Максимальная концентрация высокая высокая высокая средняя средняя
Равномерность «пробки» низкая высокая средняя Средняя высокая
В аналитическом МФУ необходимо наличие: резервуаров, в которые помещается буферный раствор и анализируемая проба; резервуаров для слива отработанного материала; системы каналов, соединяющих эти резервуары; элементов, обеспечивающих транспорт буфера и пробы, а в некоторых случаях - их смешивание. Если рассматривать электрокинстические способы управления движением потоков и метод капиллярного электрофореза, как метод разделения пробы, то наиболее простая топология МФЧ представляет систему двух пересекающихся каналов с резервуарами, которые снабжены электродами. Конструкция такого МФЧ будет состоять из двух герметично соединенных пластин - пластины с микроканалами, сосудами, электродами соединенной с защитной пластиной [63, 64].
Для создания стабильных транспортных потоков в каналах МФУ используются различные типы внешних и встроенных в микрочип насосов. Наиболее известными являются пьезоэлектрические микронасосы, электрокинетические, в том числе и электроосмотические [65] насосы.
Кроме инжекторов и устройств для создания микропотоков важным компонентом МФУ является смеситель. В микромасштабе ламинарное движение потоков с низкими числами Рейнольдса (< 10), даже в случае
соприкосновения их друг с другом, препятствует смешиванию. В МФУ есть два пути эффективного смешивания жидких потоков - пассивные и активные [66]. Пассивный смеситель не требует внешней энергии, процесс перемешивания основан на диффузионных процессах или хаотической адвекции. Используют геометрию канала или специальные микроструктуры, чтобы изменить траекторию движения жидкостей, обеспечив максимальную область их перемещения и соприкосновения. Активные смесители применяют энергию внешних полей для перемешивания и могут быть классифицированы по видам внешних воздействий: давление, температура, электрические поля, диэлектрофорез, электрокинетические процессы, магнитные поля, ультразвуковые или акустические поля. Интеграция активных смесителей в МФУ является одновременно сложной и дорогой [66]. Примеры активных смесителей: электрокинетический смеситель [67], хаотический миксер и магнитно управляемый смеситель. Иногда, для решения задач, требующих быстрого смешивания различных веществ в малых объемах, изготавливаются специальные МФЧ [68]. Выбор типа смесителя зависит от перемешиваемых реактивов, режимов смешивания, ламинарности потоков на входе и выходе смесителя. Не существует единого подхода для оценки эффективности микросмесителей вследствие противоречивых мнений о том, как правильно определить количество и качество смешивания в микромасштабе [69].
1.3Модел ирова н ие в микрофлюид яке
В микрофлюидике при рассмотрении движения потоков жидкости применяются традиционные математические модели процессов конвективнодиффузионного массопереноса. При их построении используются общепринятые базовые положения: а) гипотеза сплошной среды; б) гипотеза ламинарности потоков; в) система уравнений Навье-Стокса и непрерывности для описания распределения концентраций компонент пробы; г) система уравнений Пуассона-Больцмана для вычисления распределения
27
электрического потенциала, температурного поля и конвективного скоростного профиля; д) теория двойного электрического слоя. В большинстве случаев аналитическое решение уравнений даже для относительно простой системы получить не удается. Поэтому при моделировании процессов получили широкое распространение численные методы.
Характерные размеры функциональных элементов (каналов, реакторов, сосудов и т.д.) в микрофлюидике находятся в интервале от 1 мкм до сотен мкм. Принято, что ламинарность потока связывается с величиной числа Рейнольдса Яе, характеризующей отношение нелинейного и диссипативного
членов в уравнении Навье-Стокса: Яе = — —, где V и с! — характерные
скорость потока и геометрический размер канала (или гидродинамический диаметр), р и р — плотность и коэффициент динамической вязкости среды соответственно. При малых числах Яе течение жидкости носит ламинарный характер, при котором жидкость или газ перемешается слоями без перемешивания и пульсаций.
Приближение сплошной среды предполагает, что среда является бесконечно делимой как по пространственным, так и по временным переменным. То есть, жидкость, непрерывно заполняющая пространство (без пустот или разрывов), имеет характеристики, являющиеся непрерывными функциями с непрерывными частными производными по всем своим аргументам. Анализ применимости гипотезы проводится на основе сравнения длины свободного пробега частицы с характерным размером сечения с/, а именно - определения числа Кнудсена: Кп = Я/с1, где Я - длина свободного пробега в газе или жидкости. На основе оценок делаются следующие выводы: а) при Кп более 10° следует учитывать неравновесные эффекты в среде, 6) при К„ от 10'3 до 10’1 гипотеза сплошной среды еще правомерна и допустимо применение условия прилипания частиц к жестким стенкам канала. Расчет Я можно осуществить в соответствии с формулой
28
[701: ЯаУК/Л'я, где V - молярный объем, N(1 - число Авогадро. Для воды Л=0.3 нм [71] и даже в микроканале размером 1 мкм число Кнудсена составляет 3*10 . Т.о. гипотеза сплошной среды применима. Длина свободного пробега л может быть вычислена по формуле: Л «1/(л/2л?;2Мт),
если использовать в качестве г5 радиус Стокса для сферической аппроксимации частицы. Для модели жесткоцепной молекулы характерным размером частицы является радиус инерции 7?^, который определяется как
[72]:Л‘=д/г
О законах формирования скоростного профиля, массопсреноса, распределение электрического и теплового полей, а также граничных условиях, определяемых геометрией конструкции МФЧ, подробно изложено в обзоре [73].
Численные методы компьютерного моделирования, используемые в микрофлюидике, могут быть классифицированы в соответствии с применяемыми подходами и уравнениями: метод конечных разностей, конечных объемов и метод фаничных элементов. В методе конечных разностей частные производные дифференциальных уравнений заменяются тейлоровским приближением на основе значений для каждого соседнего узла [74]. Метод эффективен для простых геометрических элементов (капилляров, каналов). В методах конечного объема [75], моделирование осуществляется путем разделения домена на ряд контрольных объемов, каждый из которых соответствует одной точке узла. В узловых точках дифференциальное уравнение интегрируется. Метод граничных элементов предпочтителен для сложных геометрий [76, 77]. Недостатком его является трудности, связанные с обработкой элементов сложной формы или большим диапазоном размеров элемента в пределах одной сетки (например, двойной электрический слой толщиной несколько нм в канале длиной до нескольких сантиметров).
В моделировании процессов микрофлюидики применяются
коммерческие профаммы (например, РИЗЕМТ [78], РЕМЬАВ [79], СРО-
29
АСЕ + 180] и Coventor [81]). Хотя эти программы представляются удобным способом для численного анализа, но их использование предполагает знания в области вычислительной гидродинамики. Программы позволяют осуществить моделирование течений жидкости и не дают возможности провести расчет МФУ.
Некоторые исследовательские группы разрабатывают свои собственные программы, ориентированные для решения задач создания «лабораторий на чипе». Таким примером является система BLOCS (Bio-Lab-On-a-Chip Simulation) [82], позволяющая имитировать различные процессы в микрочиповом формате за счет объединенных модулей микрофлюидного транспорта, микрогермического анализа, биологических и кинетических реакций.
1.4 Материалы и методы изготовление микрофлюидных устройств
1.4.1 Материалы для микрофлюидных устройств
Большинство МФУ, в том числе и для ПЦР, изготавливают из кремния [83-85], стекла [86-88] или в сочетании кремний-стекло [89, 90]. Кроме того, наметилась тенденция применения в аналитических микрочипах полимерных материалов, например, полидиметилсилоксана (ПДМС), поликарбоната (ПК), полиметилметакрилата (ПММА), полиэтилентерефталата (ПЭТ), полиимида (ПИ), SU-8 и т.д. По данным Yole Développement [91] наблюдается изменение рынка материалов для МФУ, при общем росте более чем на 20% за последние пять лет. Востребованными становятся полимерные материалы, хотя стеклянные и кремниевые материалы все еще широко используются в микрофлюидике.
Кремний. Преимуществами кремния являются: высокая
теплопроводность; разработанные серийные технологии получения микро- и наноразмерных структур; возможность формирования электронных компонентов на подложке. Способы и процессы изготовления изделий из кремния позволяют получать сложные структуры микрометровых размеров с
зо
необходимой точностью. С кремнием могут взаимодействовать некоторые реагенты и биологические пробы, в частности, известны процессы ингибирования ПЦР [92]. Поэтому необходимо применять специальные меры по предотвращению такого взаимодействия, например, использовать специальные покрытия [93, 94]. Непрозрачность кремния создает
ограничения для методов оптического детектирования, а его электропроводность затрудняет применение элсктрокинетичсских способов разделения пробы.
Кварц и стекло. Эти материалы являются оптически прозрачными в широкой области спектра. Диэлектрические свойства кварца и стекла позволяют реализовать электрофоретические методы разделения пробы. Технологии обработки этих материалов схожи с технологиями обработки кремния [95]. Коэффициент теплопроводности стекол ниже, чем кремния, но позволяет обеспечить высокоэффективный и быстрый теплообмен (например, при амплификации пробы [88]). Герметизация стеклянных микрочипов может быть осуществлена методами термического и анодного связывания, склеиванием полимерными композициями, методом глубокого оптического контакта (ГОК) и др. [86, 87, 96-98]. В некоторых работах встречаются конструкции гибридных чипов, где используются кремниевые пластины с микроструктурами, а в качестве защитной пластины - стеклянная пластина, соединенная с кремниевой методом анодного связывания [89]. Существенным недостатком МФУ, как на основе кремния, так и на основе кварца и стекла является их высокая стоимость.
Полимеры. Полимерные материалы получили широкое распространение благодаря не только низкой себестоимости, но и простоте изготовления при массовом производстве, что позволяет создавать одноразовые чипы. Для полимеров разработаны доступные технологии формирования микроструктур, которые можно разделить на методы прямого изготовления (лазерная абляция, прецизионное микроизготовление, некоторые виды литографии и т.д.), методы изготовления с применением
31
масок и шаблонов (плазменная обработка, рентгеновская литография, варианты лазерной абляции) и методы с использованием мастер-форм (горячее тиснение, инжекционное литье, формование, LIGA-технологии и т.д.) [99, 100]. Более простыми являются способы их герметизации. Обычно используются способы термического связывания (при более низких температурах, чем для кремниевых и стеклянных материалов), склеивание полимерными композициями, ламинирование, герметизация скотчами и др. Полимеры имеют более низкий, чем у стекла коэффициент теплопроводности, что оказывает существенное влияние на скорости теплообмена.
Полидиметилсилоксан (ПДМС) - (наиболее часто используется Sylgard-184) эластомерный материал, обладающий хорошей оптической прозрачностью и лучшей биосовместимостью, чем кремний. Из ПДМС изготавливаются простые МФЧ однократного применения [101-104], он может применяться для герметизации МФЧ [105]. Способность адсорбировать компоненты реакционной ПЦР смеси у ПДМС выражена в наименьшей степени по сравнению с другими материалами. Поэтому его используют для модификации поверхности кремния и стекла с целью исключения воздействия этих материалов на результаты анализа [106]. Па поверхности 11ДМС из-за его гидрофобности могут образовываться пузырьки воздуха, адсорбироваться молекулы. Недостаток - пористость ПДМС - может быть устранена путем покрытия пленкой парилена, имеющей низкую влагопроницаемость и долговременную температурную стабильность [107].
Полиметил метакрилат (ПММА) - линейный термопластичный полимер (например, марки Perspex, Plexiglas, ТОСП). Адсорбция белков и ДНК на поверхность ПММА минимальна. Оптически прозрачен для видимого и ближнего УФ- диапазонов, имеет меньшую собственную флуоресценцию, чем другие полимеры (например, поликарбонат). Хорошо поддается различным видам обработки. Из ПММА можно сформировать изделия с микроструктурами [108], МФУ для ПЦР [109], МФУ для
32
фильтрации биологических объектов [110], МФЧ для электрофоретического разделения проб [111]. Применению Г1ММА для МФУ посвящен обзор [112].
Поликарбонат (ПК) является привлекательным материалом для ПЦР устройств (например, марки Makrolon, Calibre, I.exan, Trirex). Устойчив к спиртам и кислотам, имеет температуру стеклования 125-150°С, обладает хорошей прозрачностью в широком спектральном диапазоне. Некоторые марки ПК применяются для создания ПЦР микрочипов [113] и МФУ для электрофоретических методов [114].
Полиэтнлентерефталат (ПЭТ), имеющий низкую температуру стеклования, может быть применен в МФУ, где не требуется функционирование при повышенных температурах. Микроструктуры в ПЭТ могут быть сформированы методом горячего тиснения. В работе [1 15] для чипов из ПЭТ предложены методы плазменной обработки поверхности для улучшения соединения при герметизации.
Специально разработанный для микроэлектроники полимер SU-8 (IBM-Watson Research Center, USA) был адаптирован для применений в МЭМС [116]. Методами стандартной УФ- литографии получено аспектное соотношение для формируемых структур в SU-8 около 25. Может обрабатываться плазмо- химическими методами, химическим травлением и т.д. Температура стеклования 210°С. Материал нашел применение при создании лабораторных устройств для микроаналитической техники и, в частности, для приборов ПЦР [ 1 17-120].
Для некоторых полимерных материалов изучены вопросы
взаимодействия компонентов ПЦР смеси с поверхностью при разных временах реакции и площадях контакта [121]. При этом наблюдалась адсорбция индивидуальных компонентов смеси, флуоресцентного маркера и Д1IK на поверхности материалов, что влияло на эффективность ПЦР.
зз
- Київ+380960830922