Оглавление
ВВЕДЕНИЕ............................................................8
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................20
1.1. Клеточная люминесценция как индикатор метаболизма. Эндогенные флуорофоры и хромофоры..................................20
1.1.1 Триптофан, тирозин и фенилаланин..........................20
1.1.2 Коллаген и эластин........................................23
1.1.3 Пиридиновые нуклеотиды и флавопротеиды....................23
1.1.4 Эндогенные порфирины......................................27
1.1.5 Витамины..................................................27
1.2. Использование флуоресцентной спектроскопии in situ в клинической диагностике - флуоресцентная биопсия...................29
1.2.1. Гастроэнтерология.........................................29
1.2.2. Офтальмология.............................................30
1.2.3. Диагностика атеросклеротических бляшек....................34
1.2.4. Диагностика онкопатологии.................................41
1.2.5. Диагностика ишемии миокарда...............................43
1.2.6. Мониторинг состояния головного мозга......................47
1.3. Аппаратура для флуоресцентной биопсии.........................50
1.3.1. Оптоволоконные зонды......................................50
1.3.2. Лазеры....................................................57
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ...........................87
2.1. Лазерный стенд................................................87
2.1.1. Вакуумная система.........................................87
2.1.2. Источники высокого напряжения.............................88
2.1.3. Генераторы наносекундных импульсов высокого напряжения 88
з
2.1.4. Система регистрации лазерного излучения
89
2.2. Разработка методик медицинской диагностики для лазерного спектрофлуориметра...................................................90
2.3.1 Использование лазерного спектрофлуориметра для проведения
доклинических исследований.........................................90
Флуоресценция тканей брюшной полости при перитоните..............90
Флуоресценция миокарда при острой ишемии.........................91
Флуоресценция тканей головного мозга.............................94
2.3.2 Использование лазерного спектрофлуориметра для проведения
клинических исследований...........................................96
Исследование катаракты...........................................96
Исследование роговицы.......................................... 100
2.3.3 Алгоритмы обработки данных измерений лазерным
спектрофлуориметром...............................................102
2.3. Исследование молекулярных мишеней действия лазерного излучения в биологических комплексах................................104
2.3.1 Исследование пиридиновых нуклеотидов.......................104
Иммунологические эффекты лазерной радиации..................... 104
Влияние лазерной радиации на генерацию АФК клетками системы
иммуногенеза................................................... 105
Флуоресценция макрофагов in vitro.............................. 107
2.3.2 Исследование гемопротеидов.................................109
Исследование лазерной фотодиссоциации карбоксигемоглобина 109
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ....................................115
3.1. Наносекундный генератор мощных импульсов напряжения 115
3.3.1. Цепь магнитного сжатия и умножения напряжения импульса.....115
3.3.2. Высоковольтный генератор наносекундных импульсов...........117
3.2. Лазерные источники.............................................130
3.2.1. Компактный импульсный газовый лазер и устройство магнитного сжатия импульса для его возбуждения...............................130
4
3.2.2. Азотный лазер с продольным разрядом, возбуждаемый схемой магнитного сжатия и умножения напряжения импульса, с выходной энергией 1 мДж................................................143
3.2.3. Самопробойный волноводный азотный лазер..................147
3.2.4. Перестраиваемый лазер на красителе с накачкой компактным Ы2-лазером с линией магнитного сжатия.........................151
3.3. Лазерный спектрофлуориметр для оптической биопсии............156
3.3.1. Общая компоновка и функционирование......................156
Оптическое волокно, датчики и зонды...........................159
Система регистрации...........................................161
Блок питания................................................. 162
3.3.2. Программное обеспечение лазерного спектрофлуориметра.....170
3.4. Исследование флуоресценции тканей брюшной полости при перитоните........................................................183
3.5. Исследование флуоресценции миокарда при острой ишемии 186
3.5.1 Исследование влияния кардиоплегии на динамику острой ишемии миокарда......................................................186
3.5.2 Влияние восстановительного потенциала кардиоплегического раствора на динамику метаболических показателей миокарда......193
3.6. Флуоресценция тканей головного мозга при ишемии и аноксии 203
3.7. Флуоресцентная диагностика стадий возрастной катаракты 214
3.8. Исследование аутофлуоресценции роговицы......................224
3.9. Исследование активности Т-лимфоцитов при УФА лазерном облучении.........................................................228
3.10. Исследование активности полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови при УФА лазерном облучении...................235
5
3.11. Исследование флуоресценции макрофагов in vitro...............239
3.12. Клеточные гемопротеиды как мишени действия лазерного излучения в модельных системах.....................................245
3.13. Исследование фотодиссоциации гемопротеидов при действии лазерного излучения................................................246
3.13.1. Раствор гемоглобина......................................246
3.13.2. Цельная кровь............................................252
3.13.3. Спектр фотодиссоциации карбоксигемоглобина...............257
ВЫВОДЫ.............................................................263
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
265
6
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АТФ - аденозинтрифосфат
АФК - активные формы кислорода
АЦП - аналого-цифровой преобразователь
АЧХ - амплитудно-частотная характеристика
ВЗМО - верхняя занятая молекулярная орбиталь
ГИН - генератор импульсного напряжения
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ЗГ - задающий генератор
ИИП - импульсный источник питания
ИКК - иммунокомпетентные клетки
ИП - источник питания
КПД - коэффициент полезного действия
ЛМС - линия магнитного сжатия
МДА - малоновый диапьдегид
НАД+ - никотинамидадениндинуклеотйд
НАДН - никотинамидадениндинуклеотйд восстановленный
НАДФ+ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат
НАДФН - иикотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный
НВМО - нижняя вакантная молекулярная орбиталь
НСТ - нитросиний тетразолий
ПЛИС - программируемая логическая интегральная схема СВ - сетевой выпрямитель УФ - ультрафиолет
УФА- ультрафиолет А, длинноволновой диапазон, 400 нм - 315 нм
ФП - флавопротеид
ФАД - флавинадениндинуклеотид
ФМН - флавинмононуклеотид
ФЭУ - фотоэлектронный умножитель
ХЛР - хемилюминесцентная реакция
7
ЦАП - цифро-аналоговый преобразователь ЧСИ - частота следования импульсов ШИМ - широтно-импульсная модуляция АС - alternating current (переменный ток)
ATX - Advanced Technology extended
CD - cluster of differentiation
DoxHb - дезоксигемоглобин
Hb - гемоглобин
HbCO - карбоксигемоглобин
NSOM/SNOM - Nearfield Scanning Optical Microscopy OLE - Object Linking and Embedding
PBS - phosphate-buffered saline solution
USB - Universal Serial Bus
Win32 API - Microsoft's core set of application programming interfaces 32 bit
8
ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы.
В современной медицинской диагностике широкое распространение получили оптические методы исследования живых тканей in situ, получившие название «оптическая биопсия» (Optical Biopsy) (Bigio, 2003, Popp, 2006). Применение оптической биопсии, в отличие от обычной биопсии, предполагает, что ткань не извлекается и не модифицируется тем или иным способом (например, для гистологического исследования), а используется та или иная форма оптических измерений, часто спектроскопических, выполняемых неинвазивно или минимально инвазивно с целью поставить диагноз, на месте, in vivo и в режиме реального времени. В оптической биопсии используются как оптическая спектроскопия -абсорбционная, флуоресцентная, спектроскопия комбинационного рассеяния света ( Приезжев, 1989, Тучин, 2010, Li, 2004, Li, 2006, Mahadevan-Jansen, 1996, Mahadevan-Jansen, 1997, Mahadevan-Jansen, 1998a, Mahadevan-Jansen, 1998b, Mahadevan, 1995, Majumder, 2008, Utzinger, 2001, Yazdi, 1999), так и методы медицинской оптической визуализации - оптическая когерентная томография (Brezinski, 1996), конфокальная лазерная эндомикроскопия, эндоцитоскопия (Newton, 2011). Основное преимущество использования оптической биопсии по сравнению с другими способами прижизненного исследования органов и тканей заключается в высокой скорости проведения анализа. Зачастую результат может быть получен в режиме реального времени, а также имеется возможность исследования бысгропротекающих процессов в пикосекундном и фемтосекундном интервале длительностей. Вторым достоинством является возможность исследований с высоким пространственным разрешением. Размер анализируемой зоны в сочетании с конфокальной сканирующей микроскопией (Gu, 1996, Wahl, 2004, Wilson, 1989а, Wilson, 1989b, Wilson, 1999) может быть по порядку величины сравним с длиной полны оптического диапазона, а со сканирующей
9
микроскопией ближнего поля (Near Field Scanning Optical Microscopy (NSOM/SNOM)) (Kumar, 2006) - значительно меньше. Наконец, уникальным свойством оптической биопсии но сравнению с другими средствами медицинской визуализации является возможность прямого исследования метаболических превращений в клетках живых тканей (Adachi, 1999, Vishwasrao, 2005).
Среди методов оптической биопсии особое место занимает анализ люминесценции живых тканей. Во-первых, этот метод обладает наивысшей чувствительностью. В отдельных случаях удается детектировать единичные атомы или молекулы в анализируемой зоне (Brau, 2006, Cannone, 2003, Johnson, 2005, Peleg, 1999, Wahl, 2004, Weiss, 1999). Во-вторых, параметры люминесценции весьма чувствительны к состоянию микроокружения флуоресцирующего агента (флуорофора), что позволяет отслеживать степень его агрегации, свойства микроокружения, включая полярность и жесткость среды, наличие поблизости зарядов и молекул - акцепторов энергии электронного возбуждения (Lakowicz, 2006). Флуоресцентные методы оптической биопсии можно условно разделить на два класса: 1) методы, основанные на регистрации флуоресценции эндогенных флуорофоров -аутофлуоресценции (Monici, 2005); 2) методы, использующие различные флуоресцирующие соединения - флуоресцентные метки и зонды, вводимые в ткань для визуализации исследуемых процессов (Michalet, 2005).
В настоящее время накоплен обширный материал по использованию флуоресцентных зондов в исследовании клеток, клеточных мембран и липопротеинов (Владимиров, 1980, Добрецов, 1989). Имеется также обширный арсенал методов, основанных на использовании меченых флуорофором соединений - иммуногистохимические (Renshaw, 2007) и иммуноцитохимические протоколы (Polak, 1997). Для перечисленных методов разработано и продолжает разрабатываться огромное количество соединений, однако большей частью применение этих соединений для прижизненной диагностики не представляется возможным либо вследствие
10
их высокой токсичности, либо неустойчивости соединений в метаболически активной ткани. Еще одним недостатком использования флуоресцентно меченых соединений является то, что наличие флуоресцентной метки значительно отличает соединение от исходного по своим биохимическим, транспортным и конформационным свойствам. В этом контексте методы, использующие меченые радиоактивными атомами соединения, являются более точными.
Использование собственной флуоресценции для прижизненной диагностики тканей является наиболее привлекательным, поскольку практически не меняются условия протекания в них основных биохимических процессов. Собственная флуоресценция тканей исследуется достаточно давно. Накоплен значительный экспериментальный клинический материал по использованию этого метода в диагностических целях в различных областях медицины - гастроэнтерологии (Лисовский, 1984, Beuthan, 1996, Cothren, 1990, Lin, 2003), онкологии (Alfano, 1984, Loschenov, 1992a, Loschenov, 1994), гинекологии (Agrawal, 1999, Belyaeva, 2003, Zuev, 2001), офтальмологии (Docchio, 1989), стоматологии (Amaechi, 2002, Matsumoto, 2000, Qin, 2007, Sinyaeva, 2004), дерматологии ( Синичкин, 2001, Синичкин, 2007). Определены основные тканевые флуорофоры, разработаны различные прототипы установок для клинического использования (Loschenov, 1998, Meerovich, 1995, Meerovich, 1996, Rogatkin, 2009), предложено большое количество методик изучения типовых патологических процессов (ишемия, воспаление, неоплазия, дегенеративные изменения).
Однако, несмотря на обширный накопленный экспериментальный опыт, широкого распространения этот подход в медицинской диагностической практике до сих пор не получил. Связано это с рядом причин. Во-первых, необходимо решить вопросы стандартизации методик исследований. Сказанное в полной мере относится и ко вновь разрабатываемым методикам. Во-вторых, требуют дополнительного исследования вопросы побочных эффектов УФ лазерного излучения на
живые биологические ткани. Третьей причиной является проблема выбора лазерного источника для возбуждения аутофлуоресценции. Длительное время для УФ возбуждения аутофлуоресценции живых тканей использовался импульсный УФ лазер на молекулярном азоте (?с=337,1 нм). Выбор именно этого лазера для возбуждения аутофлуоресценции тканей основан на том, что основной тканевый флуорофор - НАД(Ф)Н - имеет один из максимумов поглощения на длине волны 340 нм. Однако азотные лазеры имеют целый ряд недостатков, ограничивающих как точность исследований, так и потребительские свойства разработанных установок.
Среди основных потребительских характеристик лазеров для оптической биопсии можно назвать малогабаритность, надежность, стабильность, большой ресурс работы и невысокую стоимость. Если важность перечисленных параметров лазеров для оптической биопсии достаточно очевидна, то такие параметры, как высокая импульсная мощность и высокая частота повторения импульсов генерации требуют пояснения. Флуоресцентный метод оптической биопсии зачастую используется в условиях значительного фонового освещения, поэтому для получения приемлемого отношения «полезный сигнал/фон» необходимо использовать метод синхронного детектирования с модуляцией источника возбуждения и высокую интенсивность возбуждающего излучения. Указанные параметры наиболее просто реализовать путем применения импульсно-периодических лазеров. При этом точность измерений будет зависеть от количества измерений сигнала флуоресценции. Очевидно, что время проведения анализа будет иметь обратную зависимость от частоты повторения импульсов. Немаловажную роль имеет также качество лазерного пучка, поскольку системы доставки излучения до объекта исследования используют оптиковолоконную технику и требуют тщательного согласования лазерного пучка с оптическим волокном.
Цель работы. Разработка физических основ применения новых эффективных источников УФ лазерного излучения для лазер-
12
индуцированной аутофлуоресцентной спектроскопии биологических тканей
в медицинской диагностике.
Задачи работы
1. Поиск новых эффективных методов возбуждения импульсных газовых лазеров и лазеров на красителях. Изучение физических процессов в азотных лазерах и разработка эффективных источников УФ лазерного излучения на их основе.
2. Разработка физических основ методов лазерной УФ-индуцированной аутофлуоресцентной спектроскопии для задач медицинской диагностики.
3. Исследование фотофизических процессов и фотобиологических эффектов при воздействии интенсивного лазерного излучения на основные эндогенные хромофорсодержащие молекулы.
Научная новизна
1. Впервые показана высокая эффективность возбуждения азотного лазера (337,1 нм) с продольным разрядом от генератора наносекундных импульсов с магнитным сжатием и умножением напряжения импульса (КПД=0,15 %, Е=1 мДж).
2. Впервые получена генерация в волноводном азотном лазере (337,1 нм) в режиме самопробоя от источника постоянного напряжения.
3. Впервые получена генерация на лазере на красителе родамин 6G при возбуждении волноводным азотным лазером, а также перестраиваемая генерация (555-580 нм) лазера на красителе родамин 6G при возбуждении азотным лазером с магнитным сжатием импульса возбуждения.
4. Впервые показано, что аутофлуоресценция органов брюшной полости (in vivo), индуцированная излучением азотного лазера (337 нм), имеет достоверно отличающиеся спектры при воспалении (перитонит).
5. Впервые показано, что при аутофлуоресценции миокарда (in vivo), индуцированной излучением азотного лазера (337 нм), динамика флуоресценции в течение 20 мин периода острой ишемии на длинах волн
13
430 и 470 нм имеет монотонный характер, и достоверно отличаются как динамика флуоресценции, так и спектры флуоресценции миокарда, подвергавшегося и не подвергавшегося кардиоплегической защите. Постоянные времени динамики флуоресценции претерпевают значимые изменения при использовании в кардиоплегическом растворе модификаторов гемопротеидов.
6. Впервые показано, что при аутофлуоресценции твердой мозговой оболочки (in vivo), индуцированной излучением азотного лазера (337 нм), спектры флуоресценции до и во время острой ишемии мозга значимо отличаются. Наибольшие отличия в нормированных спектрах флуоресценции наблюдаются на длинах волн 430 и 470 нм.
7. Впервые показано, что при аутофлуоресценции хрусталика человека (in vivo), индуцированной излучением азотного лазера (337 нм), наибольшее отличие в нормированных спектрах здоровых и пораженных возрастной катарактой хрусталиков наблюдается на длине волны 440 нм, а на длинах волн 400 и 500 нм амплитуды нормированных спектров не отличаются.
8. С использованием разработанного спектрального критерия - индекса помутнения хрусталика - впервые показано, что индекс помутнения линейно зависит от стадии развития катаракты. Впервые предложена диагностическая формула расчета стадии развития катаракты на основании измерения индекса помутнения.
9. Впервые показано, что при аутофлуоресцснции роговицы человека (in vivo), индуцированной излучением азотного лазера (337 нм), отношение интенсивностей флуоресценции на длинах волн 410 и 460 нм линейно возрастает с увеличением срока ношения контактных линз. Впервые продемонстрированы достоверные отличия указанного отношения при сроках ношения контактных линз 5 и 10 лет.
10.Впервые показан иммуномодулирующий эффект высокоинтенсивного (1=0,5-5-5 МВт/см2) излучения азотного лазера (337 нм) в отношении иммунокомпетентных клеток.
14
11.Впервые показано, что при активации макрофагов усиливается их аутофлуоресценция в области 440±10 нм при возбуждении излучением с длиной волны 340±10 нм.
12.Впервые показано, что зависимость эффективности фотодиссоциации карбоксигемоглобина от степени насыщения, имеющая максимум в области 50% насыщения, формируется за счет кооперативного характера связывания лиганда (СО) с гемоглобином.
13.Впервые определен спектр эффективности фотодиссоциации карбоксигемоглобина в области 550-585 нм при лазерном флеш-фотололизе в цельной крови человека.
Практическая значимость работы
1. Разработано устройство магнитного сжатия и умножения напряжения импульса. По разработанной схеме создан высоковольтный генератор наносекундных импульсов со следующими параметрами:
Энергия в импульсе 0,5 Дж
Амплитуда напряжения выходного импульса 150 кВ
Длительность фронта импульса напряжения 5 не
Частота следования импульсов 1000 Гц
Генератор может быть использован для питания импульсных частотных нагрузок, импульсных газовых лазеров, ускорителей частиц, клистронов, магнетронов высоковольтными наносекундными импульсами с высокой частотой повторения.
2. Разработан эффективный компактный азотный лазер с устройством магнитного сжатия и умножения напряжения импульса накачки. Лазер имеет следующие характеристики:
Длина волны 337,1 нм
Частота повторения 20 - 500 Гц
Длительность импульса на полувысоте 2 не
15
Энергия импульса Энергетическая нестабильность Импульсная мощность Средняя мощность
25 кВт
15 мВт при 400 Г'ц
50 мкДж
5%
Диаметр пучка Ресурс работы Расходимость пучка Потребляемая мощность
2 мм круглое сечение 1.2*109 имп.
3 мрад
150 Вт при 400 Гц
Размеры
30 х 15 х 15 см
Лазер предназначен для использования в следующих областях:
флуоресцентная спектроскопия с высоким временным разрешением, экологический мониторинг водоемов и почвы, медицина, оптическая биопсия, лазерная масс-спектрометрия, квантовая электроника.
3. С использованием малогабаритного азотного лазера с магнитным сжатием и умножением напряжения импульса накачки создан прототип лазерного автоматизированного спектрофлуориметра с оптоволоконной доставкой излучения для оптической биопсии. Комплекс имеет зонды для контактных одноточечных измерений, а также телескопическую приставку для дистанционных измерений.
Регистрация люминесценции осуществляется в диапазоне 360-600 нм. Спектральная ширина щели 0,3 - 20 нм.
Частота измерений 1000 с'1.
4. Разработаны и протестированы оригинальные
спектрофлуориметрические методики оценки состояния тканей (in vivo):
•брюшной полости при перитоните;
•миокарда при ишемии в условиях кардиопротекции;
•головного мозга при аноксии и ишемии;
•хрусталика при различных стадиях развития возрастной катаракты;
16
•роговицы при дегенеративных изменениях, связанных с длительным ношением контактных линз.
Положения, выносимые на защиту
1. Схема магнитного сжатия и умножения напряжения импульса позволяет эффективно возбуждать газовые лазеры наносекундным продольным разрядом.
2. В волноводных азотных лазерах с продольным разрядом реализуется механизм возбуждения генерации за счет самопробоя газа в лазерной ячейке в постоянном электрическом поле.
3. Волноводный азотный лазер и азотный лазер с устройством магнитного сжатия и умножения напряжения импульса эффективны для возбуждения лазеров на красителях.
4. УФ лазер-индуцированная аутофлуоресцентная спектроскопия при возбуждении излучением азотного лазера информативна для операционного мониторинга тканей миокарда и головного мозга при острой ишемии, тканей внутренних органов при воспалении.
5. Результаты экспериментальных исследований, методы измерений, алгоритм обработки спектров УФ лазер-индуцированной аутофлуоресценции позволяют производить дифференциальную диагностику стадий развития возрастной катаракты; степени дегенерации роговицы, вызванной ношением контактных линз.
6. Излучение азотного лазера при высоких интенсивностях модулирует активность клеток иммунной системы (молекула-мишень - ЫАДФН).
7. Эффективность фотодиссоциации карбоксигемоглобина имеет спектральный максимум, соответствующий пику а-полосы спектра поглощения, а зависимость модуляции оптической плотности от степени насыщения имеет максимум, связанный с точкой перегиба кривой насыщения.
17
Внедрение результатов исследования
Результаты, полученные в ходе диссертационного исследования, используются в работе НИИ молекулярной медицины и патобиохимии, кафедры глазных болезней, кафедры хирургических болезней № 2, кафедры биохимии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф.Войно-Ясеиецкого Минздравсоцразвития России, используются в образовательном и научно-исследовательском процессе на кафедре фотоники и лазерных технологий ФГАОУ ВПО СФУ.
Апробация работы
Результаты работы докладывались на следующих конференциях и симпозиумах: 1) Second International Conference on Laser Scattering
Spectroscopy of Biological Objects Pecs, Hungary, 29 Aug. - 2 Sept., 1988; 2) V Всесоюзной конференции по спектроскопии комбинационного рассеяния света, Ужгород, 1989; 3) Laser Applications in Life Sciences Moscow, Russia, 27 August, 1990; 4) First Russian-Chinese Seminar on Laser Physics and Laser Technology, Krasnoyarsk, Russia, June 2-8, 1993; 5) 5th International Conference on Laser Applications in Life Sciences. Minsk, Belarus, 28 June - 2 July, 1994; 6) Первая Всероссийская конференция токсикологов «Актуальные проблемы теоретической и прикладной токсикологии», Санкт-Петербург, 1995; 7) Laser Optics '95: Biomedical Applications of Lasers. St. Petersburg, Russia, 27 June 1995; 8) Russian-German Laser Symposium, St. Petersburg, Russia, 1-5 July 1995; 9) Third Russian-Chinese Symposium on Laser Physics and Laser Technology Krasnoyarsk, Russia, October 8-10, 1996; 10) IV Symposium of Japan-Russia Medical Exchange Irkutsk, Russia, 3-8 September, 1996; 11) Всероссийская научно-практическая конференция «Механизмы адаптации организма», Томск, 1996; 12) 7 Всероссийский симпозиум «Коррекция гомеостаза», Красноярск, 17-22 марта 1996; 13) Гомеостаз и окружающая среда: VIII Всероссийский симпозиум, Красноярск, 10-14 марта 1997; 14) VI Symposium of Japan-Russia Medical Exchange Foundation, Khabarovsk, Russia, 1998; 15) IX
18
Международный симпозиум «Реконструкция гомеостаза», Красноярск, 1998; 16) XVI International Conference on Coherent and Nonlinear Optics, ICONO ’98, Moscow, Russia, June 29- July 3, 1998; 17) 4th Chinese-Russian-Korean Symposium on Laser Physics and Laser Technology, Harbin, China, 1998; 18) VII Symposium of Japan-Russia Medical Exchange Hirosaki, Japan 16-17 September, 1999; 19) Всероссийская научно-практическая конференция с
международным участием “Достижения науки и техники - развитию Сибирских регионов”, Красноярск, 24-26 марта, 1999; 20) 10th European Students' Conference For Medical Students And Young Doctors, Berlin, Germany, 20-24 October 1999; 21) Научно-практическая конференция "Проблемы экологии и развитие городов" Красноярск, 5-6 июня 2ООО; 22) Saratov Fall Meeting 2000: Optical Technologies in Biophysics and Medicine II Saratov Russia, 3 October 2000; 23) 3d International Symposium on Modern Problems of Laser Physics, Novosibirsk, 2000; 24) 10th Conference on Laser Optics, St Petersburg, Russia, 2000; 25) 5th Russian-Chinese Symposium on Laser Physics and Laser Technology - Tomsk: 2000; 26) VIII Symposium of Japan-Russia Medical Exchange, Blagoveshchensk, 21-22 September, 2000; 27) 2-ая Всероссийская конференция «Достижения науки и техники — развитию сибирских регионов», Красноярск, 2000; 28) I Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии "Медицинская физика-2001", 18-22 июня 2001; 29) V Международная конференция "Импульсные лазеры на переходах атомов и молекул" г.Томск, 9-14 сентября 2001; 30) ICONO 2001 -International Conference on Coherent and Nonlinear Optics (XVII) Minsk, Belarus, June 26 - July 1, 2001; 31) 9th International Symposium of the Japan-Russia Medical Exchange, Kanazawa, Japan, 2001; 32) Atomic and Molecular Pulsed Lasers V Tomsk, Russia, Tomsk, 15-19 September 2003; 33) American Society for Microbiology Conference “Bio-, Micro-, and Nanosystems”, New York, July 7 -10, 2003; 34) 2nd International conference “High medical technologies in XXI century” Benidorm, Spain November 1-8, 2003; 35) Optical Technologies in Biophysics and Medicine, V Saratov Fall Meeting, 2003; 36) XI
19
Symposium of Japan-Russia Medical Exchange, Niigata, Japan 10-11 August, 2004; 37) IV International Symposium “Modem Problems of Laser Physics” MPLP'2004, Novosibirsk, Russia, 22 - 27 August, 2004; 38) DESORPTION-2004, Saint-Petersburg, Russia, August 29 - September 2, 2004; 39) The 7th Russian-Chinese Symposium on Laser Physics and Laser Technologies, Tomsk, Russia, December 20, 2004; 40) International Conference on Lasers, Applications, and Technologies 2005: Laser Technologies for Environmental Monitoring and Ecological Applications, and Laser Technologies for Medicine ICONO/LAT 2005 St. Petersburg, Russia, May 11-15, 2005; 41) International Conference on Lasers, Applications, and Technologies 2007: Laser Technologies for Medicine
ICONO/LAT 2007, Minsk, Belarus, 28 May 2007; 42) International Conference on Laser Applications in Life Sciences LALS 2007, Moscow, Russia, 11-14 June 2007; 43) 18th International Laser Physics Workshop LPHYS' 09, July 13 - 17, 2009, Barcelona, Spain; 44) VI Russia-Japan Workshop “Integrative Neuroscience: Molecular and Translational Medicine”, Krasnoyarsk, July 2011, семинарах и заседаниях кафедры квантовой электроники, кафедры фотоники и лазерных технологий Сибирского федерального университета (1990-2011 гг.), НИИ молекулярной медицины и патобиохимии Красноярского государственного медицинского университета имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого (2006-2011 гг.), кафедры биофизической генетики и молекулярной медицины Медицинского факультета Университета Канадзавы (Япония, 2010).
Пуб.аикации. По материалам диссертации опубликовано 85 печатных работ, из них 23 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ, получено 4 патента.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 301 странице текста, состоит из введения, трех глав, выводов и списка литературы. Работа содержит 14 фотографий, 94 рисунка, 22 таблицы. Библиографический список включает 343 источника.
20
Equation Chapter (Next) Section 1
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1.Клеточная люминесценция как индикатор метаболизма.
Эндогенные флуорофоры и хромофоры
Методическим основанием использования флуоресцентного анализа в оптической биопсии является наличие собственной флуоресценция клеток и тканей при их облучении ультрафиолетовым и видимым светом, которая реагирует на минимальные изменения их функционального состояния. Экспериментально были обнаружены наиболее важные тканевые флуорофоры: триптофан; коллаген и эластин; восстановленный
никотинамидадсниндинуклеотид (НАДН) и его фосфат (НАДФН); флавины и флавопротеины; бета-каротин; порфирины. Длины волн пиков возбуждения и люминесценции для некоторых основных флуорофоров в тканях животных (Billinton, 2001) приведены в таблице 1.
1.1.1 Триптофан, тирозин и фенилаланин
Собственная ультрафиолетовая флуоресценция живых тканей определяется, главным образом, свечением белков, причем этот процесс в различных ультраструктурах клетки имеет характерные отличия в разных органах и тканях.
Ультрафиолетовая флуоресценция белков, как и поглощение ими излучения в области 240-300 нм, обусловлена, главным образом, ароматическими аминокислотами - триптофаном, тирозином и фенилаланином (Рис. 1).
Триптофан - ароматическая аминокислота. Спектральные свойства триптофана определяются его индольным кольцом. Этой аминокислоте присущи две полосы поглощения: первая - с максимумом в области 280 нм, вторая - при 218 нм. Даже малое содержание триптофана в белке существенно влияет на характер его спектров, так как молярный коэффициент поглощения этой аминокислоты в 4 раза больше, чем тирозина, и почти в 30 раз больше, чем фенилаланина.
21
Таблица 1.
Основные флуорофоры в тканях животных
Флуорофор Клетки/ткань Аисп» НМ ^возб> нм
Флавины Клетки яичника китайского хомячка 520 380,460
Гепатоциты крыс 525 468
Бычьи и крысиные нейроны 540-560 488
Клетки внутреннего уха рыбы 540 450
НАД(Ф)Н Кардиомиоциты крыс 509 395
Гепатоциты крыс 440-470 366
Клетки яичника китайского хомячка 440-450 360
Липофусцины Миокард крыс 550 450-490
Миоциты, кардиомиоциты, гепатоциты 540-560 360
Головной мозг человека 481-673 435
Печень крысы 430 345
Сетчатка глаза крысы .510 390-490
Конечные продукты гликозилирова ния Хрусталик глаза китайского хомячка и человека 434 365
Роговица глаза человека 385 320
Кожа человека при сахарном диабете 440 365
Коллаген и эластин Аорта и коронарные артерии человека 515 476
Кожа человека 470-520 442
Протопорфи-рин IX Кожа человека при псориазе 635 442
22
При возбуждении раствора триптофана ультрафиолетом (X < 300 нм) возникает флуоресценция, максимум которой приходится на Х=350 нм. Квантовый выход флуоресценции триптофана в нейтральном водном растворе при комнатной температуре достигает 0,2. Триптофан оказывает влияние на аутофлуоресценцию клеток, когда длина волны возбуждения короче 300 нм. Для больших X вклад триптофана в аутофлуоресценцию меньший (Яататуат, 2000).
Рис. 1. Спектры поглощения (а) и люминесценции (б) триптофана (1), тирозина (2) и фенилаланина (3) ( Лисовский, 1984)
Спектральные свойства тирозина обусловлены его фенольным кольцом. Максимум в спектре поглощения приходится на 222 и 275 нм. В нейтральном водном растворе при комнатной температуре тирозин флуоресцирует, причем максимум излучения соответствует X = 303-304 нм, а квантовый выход равен 0,21 ( Конев, 1979).
Спектры поглощения и флуоресценции фенилаланина связаны с его бензольным кольцом. Максимум в спектре поглощения приходится на Х = 257 нм, а главный максимум в спектре флуоресценции раствора фенилаланина соответствует излучению на X = 282 нм; квантовый выход невелик - 0,038-0,045 ( Лисовский, 1984).
23
Если белок содержит все три перечисленные аминокислоты, то в суммарном спектре флуоресценции белковой молекулы преобладает триптофановая люминесценция. При отсутствии в белке триптофана спектры флуоресценции белковой молекулы и тирозина почти совпадают. Свечение фенилаланина выявляется только в нескольких уникальных белках, содержащих его в значительных количествах при отсутствии других ароматических аминокислот (Finazzi, 1974).
В клетках человека и животных содержится много белков, в состав которых входят триптофан, тирозин и фенилаланин. Это актин, миозин, тропонин, ферменты типа дегидрогеназ, фосфатаз, оксидаз, некоторые гормоны, такие ферменты пищеварительной системы, как пепсин, трипсин, химотрипсии, а кроме того, альбумины и глобулины плазмы крови, лизоцим и другие вещества.
Собственная ультрафиолетовая флуоресценция этих белков определяется главным образом триптофаном, причем их спектры излучения сдвинуты в коротковолновую область па 10-25 им относительно спектров люминесценции раствора триптофана ( Лисовский, 1984).
1.1.2 Коллаген и эластин Коллаген и эластин - основные белки соединительной ткани. Они присутствуют, например, в сухожилиях и тканевой строме, а также в соединительнотканных рубцах, формирующихся после воспаления или повреждения. Эпителий содержит меньше коллагена, чем окружающая строма (Mahadevan, 1993). Максимум в спектрах поглощения коллагена и эластина находится в области 320-340 нм, а в спектрах флуоресценции - на 400 нм (Deyl, 1980, Fujimoto, 1978, Ramanujam, 2000).
1.1.3 Пиридиновые нуклеотиды и флавопротеиды Одним из основных источников клеточной флуоресценции в видимой области является пул нуклеотидов - пиридиновых и флавиновых,
24
ассоциированных, прежде всего с митохондриями, а также находящихся в цитоплазме.
При люминесцентном анализе живых клеток наибольший интерес представляют восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотидов (НАДН и НАДФН) и окисленные формы флавиновых коферментов (ФАД, ФМН). Эти вещества участвуют в таких процессах, как гликолиз, пентозный цикл, цикл Кребса, окисление жирных кислот, работа дыхательной цепи митохондрий, биосинтетические процессы, окисление ксенобиотиков. Поэтому практически любые сдвиги в клеточном метаболизме отображаются в динамике свойств указанных коферментов, а она, в свою очередь, может быть выявлена при люминесцентном анализе живых тканей. Усиление клеточного дыхания сопровождается, как правило, изменением соотношения восстановленных и окисленных форм компонентов дыхательной цепи в сторону преобладания вторых. Угнетение дыхания приводит к противоположному эффекту ( Лисовский, 1984).
НАД(Ф)Н является сильным флуорофором в ткани. НАД(Ф)Н присутствует в цитоплазме и митохондриях клеток, действуя как кофермент в окислительных и синтетических процессах. НАД(Ф)Н обладает характерными спектрами поглощения, включающими две полосы в ультрафиолетовой области (при Я,=260 нм и Х=340 нм), а также типичным спектром собственной флуоресценции с максимумом, приходящимся на интервал от 455 до 480 нм. В водном растворе НАДН при возбуждении ртутной линией 365 нм флуоресцирует в голубой области с >.=468 нм и квантовым выходом 0,02 (Weber, 1957).
25
Рис. 2. Спектры поглощения (а) и люминесценции (6) НАД. 1 - окисленная форма, 2 - восстановленная ( Лисовский, 1984)
Было установлено, что переход НАДН в окисленное состояние сопровождается потерей одной из полос поглощения (при А.=340 нм) и утратой способности люминесцировать (Рис. 2). При связывании НАДН апоферментом интенсивность голубого свечения нарастает, причем максимум этой собственной флуоресценции сдвигается в коротковолновую область видимой части электромагнитного спектра А=440 нм.
Хорошо известно, что НАДФН используется клетками
преимущественно для восстановительного биосинтеза жирных кислот и стероидов, тогда как НАДН утилизируется, в основном, для генерации А ГФ, однако спектроскопия не позволяет дифференцировать эти два пула восстановленных пиридиновых нуклеотидов, что существенно осложняет интерпретацию данных, полученных при изучении параметров
аутофлуоресценции клеток и тканей.
Среди флавинов для задач спектроскопии актуальны производные рибофлавина: флавинмононуклеотид (ФМН) и флавинадениндинуклеотид (ФАД). В противоположность пиридиновым нуклеотидам, которые легко отщепляются от белковой части фермента, оба флавиновых нуклеотида всегда прочно связаны с белком, в некоторых случаях ковалентно. Флавопротеиды переносят электроны, как правило, в составе атомов водорода, от органического субстрата к рибофлавиновому компоненту
26
кофермента. Особый интерес представляют два флавопротеида митохондрий: сукцинатдегидрогеназа и НАДН-дсгидрогсназа. Последний из них катализирует восстановление своего флавинового кофермента восстановленным пиридиниуклеотидом.
Рис. 3. Спектры поглощения (а, б) и люминесценции (в) флавинов и флавопротеидов. 1, 2 - окисленная и восстановленная формы ФАД; 3 -окисленная форма липоилдегидрогеназы ( Лисовский, 1984)
В окисленном состоянии ФП обладают характерными спектрами поглощения и собственной флуоресценции, представленными на рис. 3. Видно, что им свойственна собственная люминесценция с Х=530 нм, которая обусловлена рибофлавином. Если же ФП восстанавливаются, то утрачивают собственную флуоресценцию ( Лисовский, 1984). Таким образом, изменение редокс-состояния этих молекул, оказывающее существенное влияние на спектры их флуоресценции, является основой метода флуоресцентной диагностики живых тканей. Наиболее важной является оценка соотношения интенсивности флуоресценции флавиновых и пиридиновых нуклеотидов, коль скоро реакции, протекающие с их участием, очень тесно сопряжены, и их активность в значительной степени модулируется при физиологической стимуляции клеток, гипоксии, ишемии/реперфузии, клеточной гибели.
27
1.1.4 Эндогенные порфирины Некоторые компоненты клеток обладают красным свечением - это прежде всего порфирины. Порфириновая структура присуща цитохромам, пероксидазе, каталазе, гемоглобину, миоглобину. Однако в гемопорфиринах флуоресценция «потушена» атомами железа, что ограничивает возможности се исследования в живых тканях. При обработке их некоторыми веществами атом железа отрывается от простетической группы внутриклеточных гемопорфиринов, и тогда выявляется характерная красная флуоресценция порфиринов (Лисовский, 1984).
1.1.5 Витамины
Витамины также обладают собственной люминесценцией благодаря делокализации кольцевой структуры. Таблица 2 иллюстрирует примеры флуоресценции витаминов и их спектральных свойств. Условия среды могут в значительной степени изменять их спектральные свойства (Billinton and Knight, 2001).
Таблица 2.
Эндогенные флуорофоры группы витаминов
Витамин ^»возб» НМ Лисп) НМ
Токоферол (витамин Е) 295 340
Пиридоксин (витамин В6) 300-340 350-400
Аскорбиновая кислота (витамин С) 350 430
Никотинамид (витамин РР) 360 460
Витамин О 390 470
Витамин А 340 490
Рибофлавин (витамин В2) 450-490 500-560
28
Таким образом, спектр аутофлуорссцеиции ткани является результатом наложения спектров флуоресценции большого количества тканевых флуорофоров, имеющих близкорасположенные максимумы. В этих условиях определение концентрации того или иного биохимического компонента по интенсивности флуоресценции на длинах волн, соответствующих максимумам флуоресценции чистых веществ, становится весьма непростой задачей.
Наличие в ткани гемоглобина, миоглобина, обладающих существенным поглощением в ультрафиолетовой и видимой областях спектра, влияет на форму спектра флуоресценции ткани и должно также учитываться при количественном флуоресцентном анализе. Совпадение пиков люминесценции тканевых флуорофоров с максимумами поглощения названных гемопротеидов, а также с максимумами поглощения самих флуорофоров, высокая оптическая плотность большинства биологических тканей приводят к существенной реабсорбции. Учет реабсорбции в оптически неоднородных и рассеивающих средах является одной из наиболее сложных проблем оптической биопсии тканей. Искажения спектров люминесценции могут быть вызваны также наличием у ряда органов серозных оболочек и соединительно-тканных капсул, состоящих, в основном, из коллагена и эластина, биохимические процессы в которых не обязательно совпадают с таковыми в органах, которые они покрывают.
При проведении анализа в течение длительного времени может произойти фотообесцвечивание флуорофора. Скорость этого процесса зависит как от интенсивности лазерного излучения, падающего на ткань, так и от метаболической активности ткани. С другой стороны, указанный эффект может служить основой флуоресцентных методик оценки скорости метаболических процессов, протекающих в ткани.
- Київ+380960830922