КР спектроскопия и анализ динамики лазерного фотообесцвечивания, как методы исследования функционально-значимых изменений структуры белковых молекул

2
Оглавление
Введение.................................................................... 5
Глава I. КР спектроскопия в исследованиях белковых молекул —............12
§ I. Техника КР спектроскопии..............................................12
1.1. История развития КР.................................................12
1.2. Основы теории КР спектроскопии......................................15
§ 2. Особенности строения и функционирования белковых макромолекул 16
2.1. Основы строения белков..............................................16
2.2. Взаимодействие белков с лигандами...................................19
2.3. Особенности структуры белков в твердом состоянии....................20
2.4. Влияние органических растворителей на структуру и функции белков....21
2.5. а-Химотрипсин и растительные токсины, как молекулярные машины.......24
§ 3. Исследование структуры и функциональных групп белков по данным КР спектроскопии............................................................27
3.1. КР спектры белков...................................................27
3.2. Определение вторичной структуры белков по спектрам в облает колебаний амид I и амид 111...................................................30
3.3. Установление структуры боковых цепей................................32
3.4. Апатит низкочастотной спектральной области :........................34
Заключение к главе 1.......................................................36
Глава 2. Эффект фотообесивечивания фона в спектрах КР н прецизионные методы измерения температурного поля ..м.....................................37
§ 1. Широкополосный фон в спектрах КР......................................37
§ 2. Методы высокочувствительной регистрации температурного поля...........40
Заключение к главе 2.......................................................42
Глава 3. Методика измерений и обработки полученных результатов ..............43
§ I. Описание КР спектрометра..............................................43
1.1. Оптическая схема спектрометра.......................................43
1.2. Особенности полнхроматора...........................................49
§ 2. Методика измерений и обработки спектров КР и кинстнк фотообесивечивания
...........................................................................51
§ 3. Описание экспериментальной установки для высокочувствительной регистрации нагрева образцов.............................................55
3
3.1. Оптическая схема установки...........................................55
3.2. Особенности виртуальной системы регистрации..........................56
§ 4. Методика прецизионной регистрации наг рева оптически тонких жидкостей и растворов лазерным излучением.............................................59
4.1.11остановка задачи о преломлении лазерного пучка тепловой линзой 59
4.2. Экспериментально измеряемые параметры................................62
4.3. Распределение температуры в исследуемой среде........................63
§ 5. Методика приготовления образцов........................................69
Основные результаты главы 3.................................................72
Глава 4. Эффект "инверсии" и активации функции а-химотрипсина: изменение структуры молекулы............................................................73
§ 1. Структура молекулы а-химотрипсина в водной среде, порошке, кристаллическом состоянии и суспензиях в органических растворителях.......73
§ 2. Изменения структуры молекулярной машины в процессе активации при
"инверсии" функции белка....................................................78
2.1. Изменения вторичной структуры, конформации связей и аминокислотных остатков т ирозина и триптофана...........................................78
2.3. Влияние 18-краун-6 на структуру поверхностных аминогрупп белка 80
Основные результаты главы 4.................................................85
Глава 5. Особенности структуры функционально-значимых элементов молекул растительных токсинов.........................................................86
§ 1. Сравнительное исследование структуры растительных токсинов в водной среде и кристаллическом состоянии...............................................86
§ 2. Определение конформации дисульфидных мостиков в молекулах растительных токсинов..................................................................91
Основные результаты главы 5.................................................95
Глава 6. Определение характеристик растворов биомолекул с помощью анализа кинетик фотообесивечивания и измерение локального нагрева раст воров лазерным излучением...........................................................96
§ I. Кинетики фотообесивечивания растворов растительных токсинов............96
§ 2. Простейшая модель фотообесцвечивания..................................103
4
§ 3. Исследование эффекта фотообесивечивания сыворотки крови..............106
§ 4. Прецизионное измерение локального нагрева растворов лазерным излучением .......................................................................109
Основные результаты главы 6...............................................111
Заключение 112
Синеок литературы 116
5
Введение
Быстрое развитие лазерное техники и лазерных технологий в последние несколько десятков лет послужило причиной появления огромного количества направлений в физике, химии, биологии и медицине, явившихся базовой основой для развития новых методов биофизики, физической химии и биохимической физики. В настоящее время методы лазерной физики я аз я юте я реально незаменимыми при решении широкого круга исследовательских и прикладных задач. На стыке лазерной физики и биологии возникло новое направление исследований - лазерная спектроскопия биологических макромолекул.
Исследование структуры белков является одной из наиболее важных задач при изучении биологических молекул, так как в подавляющем большинстве случаев функциональная активность белков связана с их структурой. Опираясь на данные о структуре бслков-фсрмснтов, в частности, становится возможным создавать лекарственные препараты направленного действия с заведомо известной активностью и синтезировать новые химические препараты.
Организация молекулы белка не является случайной. Белки - сложные структуры с элементами периодичности чрезвычайно чувствительные к большому числу внешних факторов. Белок представляет собой сложную колебательную систему с запрограммированными функциями и, по сути, является молекулярной машиной, в которой перемещение отдельных функциональных групп имеет направленный характер и зависит от их структуры. Молекулы белков состоят из одинаковых элементов - аминокислот. Всею различных аминокислот двадцать, а общее число аминокислотных остатков в белке может достигать нескольких тысяч. Эти особенности делают белки похожими по химическому составу, так что основные различия между белками связаны с их размерами и структурой.
В особый класс белковых молекул выделяются белки-ферменты -биологические катализаторы, присутствующие во всех живых клетках. Их объединяет общая глобальная функция - осуществление превращения веществ в организме, направленное на регуляцию обмена веществ. Функционирование каждого отдельного фермента направлено на преобразование определенного субстрата. Так, например.
6
протсазы катализируют расщепление пешидных связей в белках и пептидах. Особенности структуры и функций одного белка являются характерными и для других белков-ферментов того же типа.
Большое внимание, особенно в последнее время, уделяется разработке и получению лекарственных препаратов на основе иммунотокеннов. Функционирование последних тесно связано с их структурой. Гак. например, известно, что для успешною воздействия растительною токсина рицина на клетку должно происходить разделение молекулы токсина на две части, сопровождающееся разрывом дисульфидной связи между ними.
Оптические методы исследования все чаще применяются в исследованиях биологических объектов, а также биомедицинской диагностике и терапии [I. 2. 3). Методы лазерной спектроскопии позволяю! получать прямую информацию о структуре и подвижности функциональных трупп биомолекул.
Лазерные источники света характеризует одновременное сочетание нескольких свойств. К ним относятся: узкая ширина полосы лазерного излучения, высокая мощность излучения и когерентность. Только сочетание этих свойств позволяет успешно проводить эксперименты по различным видам спектроскопии биологических молекул.
Лазерная спектроскопия комбинационною рассеяния света (КР) является одним из самых информативных методов исследования конформации белков, наряду с рсттггснострукгурным амалтгзом н спектроскопией ЯМР. Основные преимущества метода следующие. КР спектроскопия в равной степени пригодна для исследования жидкостей, растворов, газов, пленок, поверхностей, волокон, твердых веществ и кристаллов. Кроме того, количества веществ, необходимые .гля исследовании этим мегодом ограничены лишь поперечными размерами сфокусированною лазерного луча. Следует от метить, что при использовании некогережных источников возбуждения достичь размера пя тна фоку сировки, сравнимого с таковым от лазерного источника, невозможно. Узкая спектральная ширина линии лазерного возбуждения и использование многоканальной системы регистрации позволяег измерять КР спектры в диапазоне от 10 до 4000 см'1. Вместе с тем. высокая мощность лазерного излучения обеспечивает получение информативных спектров даже при небольших
7
концентрациях нсщесіна. поскольку к видимом диапачоне белки практически прозрачны. Однако, многие белковые молекулы могут быть получены лишь в незначительных концентрациях, и поэтому повышение эффектвносги светосбора и оптимизация оптических схем КР спектрометров представляет собой отдельную важную задачу. Методы КР спектроскопии позволяют получать уникальную информацию о структуре различных связей (пептидных, дисульфндных и т.д.) в молекулах белков.
Несмотря на малый коэффициент поглощения белков в видимой области, вопрос о воздействии лазерного излучения на молекулы белка очень актуален. Это, в частности, связано с гсм. что в КР спектрах практически всех веществ присутствует широкополосный фон, интенсивность которого уменьшается во времени при облучении образца. Последнее обстоятельство наводит на мысль о возможности деструктивною воздействия лазерною излучения на исследуемое вещество. Для контроля температуры образца при облучении могут быть использованы различные методы. Оптические методы регистрации температурного поля позволяют добиться высокой точности измерений и регистрировать изменение температуры в матих объемах вещества.
Цель и задачи диссертационной работы
Цслыо диссертационной работы является разработка комплексного подхода для решения задачи определения функционально-значимых изменений структуры белковых молекул, происходящих при их переходе в различные агрегатные состояния и взаимодействии с веществами, способными изменить их пространственную конфшурацию; разработка модели фотообесцвечивания образцов и развитие новых методов диаітюст нки молекул этим методом.
В диссертационной работе решаются следующие задачи:
1. Создание и оптимизация оптической схемы лазерного КР спектрометра с целью повышения его чувствительности.
2. Аналтгз эффекта "инверсии" функции сс-химотрипсина в органических растворителях и выявление физических причин усиления этого эффекта в присутствии краун эфира.
8
3. Сравнение структуры растительных токсинов в водной среде (данные КР спектроскопии) и кристаллических образцах (данные рентгеноструктурною анализа). Определение структурных особенностей дисульфидных связен в молекулах растительных токсинов.
4. Оценка тепловою воздействия лазерного излучения на жидкости и растворы при измерении КР спектров.
5. Разработка модели фотообссцвсчнвання водных растворов биологических молекул и сыворотки крови человека с целью проведения диагностики структуры молекул.
6. Разработка методики измерения и обработки кинетик фотообесцвечивания жидкостей и растворов.
Научная новизна
1. Методом КР спектроскопии впервые проведено исследование особенностей структуры растительных токсинов в водной среде и структурных изменений белка-ферменга а-химотрипсина, связанных с "инверсией" функции.
2. Установлено, что белок-фермент а-химотрнпенн может находиться, по крайней
мере, к грех основных конформационных состояниях, которые соответствуют
водному раствору, безводному окружению (органические растворители,
лиофилизованпый образец) и взаимодействию белка с !8-краун-6 в безводном окружении.
3. Впервые предложена модель, позволяющая описать процесс фотообесцвечивания растворов, опирающаяся на гипотезу о флуоресцентной природе широкополосного фона в КР спектрах.
4. Показало, что анализ кинетик фотообссцвсчнвання растворов биополимеров и сыворотки крови человека может быть применен для разработки принципиально нового метода диагностики структуры молекул.
5. Предложена новая модификация метода тепловой линзы, позволяющая
одновременно с регистрацией КР спектров измерять локальный на1рев жидкостей, индуцированный лазерным т«лучением. Предложенный метод не уступает по точности известным методам измерения слабых нагревов и обладает рядом преимуществ.
Практическая ценность
9
Созданные экспериментальные усіановки позволяют проводить исследования структуры молекул белков в растворах, суспензиях и твердом состоянии методом КР спектроскопии и с помощью анализа кинсгик фогообесцвечивания; с высокой точностью измерять нагрев жидкостей и растворов, вызванный лазерным излучением. Установки моїуг быть использованы для решения широкого круга задач в различных областях химии, биологии и медицины. Лазерное возбуждение позволяет выявлять имеющие функциональное значение структурные изменения биологических макромолекул.
Структура и обьем диссертации
Диссертация состоит из введения, шести глав и заключения. Работа изложена на 133 страницах, включаег 47 рисунков, 3 таблицы и список литературы из 203 наименований.
Результаты изложены в шести главах.
Первая глава посвящена обзору работ, относящихся к спектроскопии КР белковых молекул. Представлен обзор литературы, включающий основные этапы развития спектроскопии КР и современное состояние спектроскопических исследований белков этим метолом. Сформулированы основы метода КР спектроскопии. Обсуждаются особенности строения молекул белков и методики исследования структуры различных функциональных групп белков с помощью КР спектроскопии. Рассмотрены известные литературные данные о структурных превращениях белков при взаимодействии с лигандами, особенностях структуры белков в твердом состоянии и влиянии органических растворителей па структуру и функции белков. Приводится описание особенностей функционирования белка-фермента а-химотрипсина и некоторых растительных токсинов с точки зрения работы молекулярных машин.
Во второй главе проводится обзор работ, посвященных эффекту фогообесцвечивания широкополосного фона в спекірах КР и высокоточному измерению температурного поля. Рассматривается феномен наличия широкополосного фона в КР спекірах подавляющего большинства веществ. Дан обзор различных методов высокочувствительной регистрации нагрева оптически тонких сред лазерным излучением.
10
Трет ья глава посвящена обсуждению методик измерений и обработки данных. Описыпае1ся экспериментальная установка для измерения спектров КР и рассматриваются особенности оптической схемы полихроматора. Предлагается новый метод прецизионной регистрации на1рсва оптически тонких жидкостей и растворов лазерным излучением. Приведено описание экспериментальной установки для высокочувствительной регистрации нагрева образца лазерных« излучением. Дано подробное описание виртуальных приборов, входящих в состав системы регистрации, основанной на принципе синхронного детектирования. Обсуждаются методики измерения и обработки спектров КР. кинстик фогообесцвечивания образцов. Описывается методика приготовления образцов.
Четвертая глава посвящена лазерной КР спектроскопии молекул белка а-химотрнпсина. Известно, что мри помещении в ортанические растворители функция сх-химотрипснна "инвертируется". Кроме того, активность фермента в органических растворителях воз растает на не сколько порядков при добавлении краун эфиров. Эти функциональные изменения были проинтерпретированы с точки зрения изменения структуры фермента.
В пятой главе исследуются особенности структуры функционально-значимых элементов структуры растительных токсинов. Проведет« сравнительный анализ конформации дисульфидных мостиков в молекулах токсинов в водной срсдс и в кристаллическом состоянии. Исследовано различие транспортной и активной субъединиц рицина.
Шестая глава посвящена исследованию некоторых явлений, протекающих одновременно с комбинационным рассеянием: эффекта фогообесцвечивания исследуемых образцов и их ншрева возбуждающим лазерных« излучением. Предлагается простейшая модель фогообесцвечивания образцов, основанная на предположении о флуоресцентной природе фона. Исследованы кинетики фогообесцвечивания водных растворов растительных иммунотокенноп и сыворотки крови человека. Проводится прецизионное измерение локального нагрева растворов лазерным излучением с использованием новой экспериментальной методики, основанной на методе тепловой линзы.
В заключении сформулированы основные результаты и выводы работы.
11
Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на
следующих научных конференциях:
1. VII Международная конференция "Применение лазеров в науках о жизни" -Laser Applications in Life Sciences, LALS'98 (Братислава. Словакия, 1998);
2. IV Международная конференция студентов и аспирантов но фундаментальным наукам "Ломоносов 98" (Москва. Россия, 1998);
3. XVI Международная конференция по когерентной и нелинейной оптике 1C0N0'98 (Москва. Россия, 1998);
4. V Международная конференция студентов и аспирантов по фундаменгальным наукам "Ломоносов-99" (Москва, Россия, 1999);
5. VIII {Европейская конференция по спектроскопии биологических молекул -"European Conference on the Spectroscopy of Biological Molecules", ECSBM'99 (Энсхеде. Голландия, 1999);
6. II Съезд биофизиков России. (Москва. Россия, 1999);
7. VI Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-2000" (Москва. Россия, 2000);
8. Школа-конференция "Горизотггы физико-химической биологии", (Пущино, Россия, 2000);
9. XIX Международная конференция по нелинейной спектроскопии рассеяния света, "European CARS Workshop", (Москва, Россия. 2000);
10. Международная конференция по биокатализу "Biocatalysis'2000", (Москва. Россия. 2000);
11.1 Международная конференция но лазерной оптике для молодых ученых. "Laser Optics for Young Scientists",LOYS'2000 (Санкт-Пегербург, Россия. 2000);
12. VIII Международная конференция "Применение лазеров в науках о жизни" Laser Applications in Life Sciences, LALS'2(KK> (Токио, Япония, 2000);
13. XVII Международная конференция по КР спектроскопии, "International Conference On Raman Spectroscopy". ICORS’2000 (Пекин, Китай, 2000);
14. Международная конференция "Supramolccular Chemistry". (Урбино, Италия, 2000);
15. Биомедицинский оптический симпозиум. "Biomedical Optics Symposium", BiOS'2001 (Сан Хосс. Калифорния. США. 2001);