Разработка средств и методов серологического мониторинга классической чумы свиней на основе твердофазного иммуноферментного анализа

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........................................... 7
1. ВВЕДЕНИЕ................................................. 9
1.1. Актуальность работы.................................... 9
1.2. Цель и задачи исследований.............................. 10
1.3. Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые
на защиту................................................... 11
1.4. Научная новизна исследований............................ 12
1.5. Практическая значимость исследований.................... 12
1.6. Апробация работы........................................ 13
1.7. Публикации.............................................. 13
1.8. Личный вклад соискателя................................. 13
1.9. Структура и объём работы................................ 13
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................... 14
2.1. Современная таксономия, патогенность вируса............. 15
2.2. Культивирование вируса КЧС in vitro..................... 16
2.3. Патогенез, течение и симптомы болезни................... 18
2.4. Природная очаговость.................................... 22
2.5. Специфическая профилактика.............................. 24
2.6. Достижения молекулярной биологии вируса и их роль в развитии методов лабораторной диагностики КЧС................ 25
2.7. Средства и методы дифференциальной лабораторной диагностики классической чумы свиней......................... 27
2.7.1. Прямое обнаружение вирусных антигенов................. 28
2.7.2. Изоляция и идентификация инфекционного вируса КЧС.......................................................... 29
2.7.3. Обнаружение вирусспецифических антител................ 29
2
2.7.4. Моноклональные антитела - получение и использование для прямого обнаружения вируса.............................. 30
2.8.1. Гистохимические методы иммуноферментного анализа 32
2.8.2. Методы твёрдофазного иммуноферментного анализа (ЕЫБА) для обнаружения антител к вирусу КЧС в пробах
сывороток крови............................................. 33
2.9. Заключение............................................. 35
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ................................. 37
3.1. Материалы.............................................. 37
3.1.1. Вирусы............................................... 37
3.1.2. Сыворотки............................................ 37
3.1.3. Животные............................................. 38
3.1.4. Культуры клеток...................................... 38
3.1.5. Основные реактивы и приборы.......................... 39
3.1.6. Диагностические препараты............................ 42
3.2. Методы................................................. 42
3.2.1. Культивирование и титрование вируса КЧС.............. 42
3.2.2. Приготовление специфических и нормальных
культуральных антигенов..................................... 43
3.2.3. Культивирование и титрование рекомбинантного вируса осповакцины................................................. 43
3.2.4. Получение сывороток крови............................ 44
3.2.5. Получение моноклональных антител..................... 44
3.2.6. Приготовление иммунопероксидазных конъюгатов......... 44
3.2.7 Определение концентрации белка........................ 45
3.2.8. Электрофорез и иммуноблоттинг........................ 45
3.2.9. Методы иммунофлуоресценции........................... 46
3.2.10. Реакция нейтрализации флуоресцирующих микробляшек................................................. 47
3.2.11. Гистохимический иммуноферментный анализ............. 47
3
- Определить оптимальные условия получения антигенов вируса классической чумы свиней, их концентрирования и очистки для использования в методах ТФ ИФА.
- Разработать тест-систему на основе моноклональных антител (МА) для технологического контроля активности протективных антигенов вируса классической чумы свиней.
- Разработать тест-систему с использованием рекомбинантного белка Е2 вируса классической чумы свиней, экспрессируемого вирусом осповакцины для выявления антител к вирусу классической чумы свиней в сыворотках крови свиней.
- Определить чувствительность, специфичность и коэффициент корреляции результатов разработанного непрямого метода ТФ ИФА на основе рекомбинантного белка Е2 по отношению к результатам PH.
- Оценить эффективность разработанного ’’Набора препаратов для выявления специфических антител к вирусу классической чумы свиней непрямым методом ТФ ИФА на основе рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС" при проведении серологического мониторинга и определения напряженности иммунитета свиней при классической чуме свиней в условиях свинокомплексов и охотхозяйств.
1.3. Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые на защиту:
- Прямой метод ТФ ИФА на основе моноклональных антител для технологического контроля при получении протективных антигенов вируса классической чумы свиней и определение условий оптимального накопления, концентрирования, очистки рекомбинантного белка Е2 вируса классической чумы свиней.
- Непрямой метод ТФ ИФА для выявления специфических антител к вирусу классической чумы свиней в сыворотках крови свиней с
использованием в качестве антигена рекомбинантного белка Е2 вируса классической чумы свиней, экспрессируемого вирусом осповакцины и конъюгата моноклональных антител к \% в свиней.
- Чувствительность и специфичность разработанного непрямого метода ТФ ИФА и определение корреляции его результатов с результатами полученными с использованием PH.
- "Набора препаратов для выявления специфических антител к вирусу классической чумы свиней непрямым методом ТФ ИФА на основе рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС" при проведении серологического мониторинга классической чумы свиней в практике полевых исследований на свинокомплексах и в охотхозяйствах.
14.. Научная новизна исследований.
Разработан метод концентрирования и очистки рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС на основе вектора вируса осповакцины.
Разработан непрямой метод ТФ ИФА для обнаружения специфических к ВКЧС антител в сыворотках крови свиней, пригодный для проведения серологического мониторинга КЧС.
Показана корреляция между результатами выявления антител с помощью разработанного непрямого метода ТФ ИФА на основе рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС и PH, изучена диагностическая ценность разработанного непрямого метода ТФ ИФА.
15. Практическая значимость исследований.
На основании результатов проведенных экспериментов, апробации при проверке полевых материалов и результатов комиссионных испытаний разработанный непрямой метод ТФ ИФА рекомендован для определения напряженности иммунитета при КЧС после вакцинации животных на
12