РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дослідження проводилися на білих щурах лінії Вістар різної статі та віку: молодих, 4-5 місячних тваринах масою 140-160 гр. та старих 1-1,5 -річних твари-нах масою 240-280 гр. Усього було поставлено в 80 серіях 704 експерименти. Дослідження проведено в умовах синтетичної постановки експеримента.
Загальне рентгенівське опромінення проводили на установці РУМ-17 (доза - 0,0129 Кл/кг, потужність дози - 0,143 мА/кг, напруга - 200 кВ, ампераж - 15 мА, фільтр - Cu 0,5, шкіряно-фокусна відстань - 50 см, час - 1,6 мін, поле - 20X20). Всі групи тварин отримували аналогічну дозу опромінення впродовж 1 доби, 1, 2 і 3 тижнів. Викликані радіацією зміни оцінювали по досягненню даної дози.
2.1 Вивчення орієнтовно-дослідницької активності у
"відкритому полі"
Поведінкові реакції вивчалися за методом "відкритого поля". Для вивчення поведінки щурів у "відкритому полі" використовувалася площадка розміром 60см х 60 см з розкресленими на ній 25 квадратами і 16 "нірками" (отвори забезпечені фотоелементом), підключена до лічильника. Тварина вміщувалася в центр майданчика. Спостереження продовжувалося 3 хвилини. При цьому реєстрували кількість пересіченних квадратів (горизонтальна рухова активність), число заглядань у "нірки" (дослідницька активність), активність проведення чищення (грумінг), кількість підйомів на задні лапи (вертикальна рухова активність), число болюсів дефекацій (емоційна активність) [22].
Одним з найбільш важливих показників інтегративної діяльності ЦНС являється здатність до відтворення енграми пам'яті.Для оцінки останньої нами використовувалась широко відома методика виробки умовної реакції пасивного уникнення (УРПУ).
2.2 Вивчення умовної реакції пасивного уникнення
Дослідження мнестичних процесів проводили за допомогою методу, заснованого на формуванні умовного рефлексу пасивного уникнення (УРПУ). В експерименті при однократному електрошкірному больовому підкріпленні використовувалася камера, що складається з двох відсіків: великого освітленого і малого темного, сполученого отвором у вигляді "нірки". Тварину садовили в центр світлого відсіку хвостом до отвору. Щурів без "норкового" рефлексу (спостереження на протязі 3 хвилин) в дослід не брали. При обстеженні освітленого відсіку щур знаходив "нірку" і проникав до неї. Через 0,5-1 секунди після заходження щура в "нірку" на електрифіковану підлогу темної частини камери подавався змінний струм (частота 50 Гц, тривалість стимулів 10 мс) величиною, рівною 1,5 больовим порогам, доки тварина не покидала "нірку". Якщо на протязі 3 хвилин тварина, що перебігла в світлий відсік, не намагалася повернутися в темну камеру, УРПУ вважалася виробленою з одного пред'явлення. Щурів, що повторно зайшли в темний відсік на протязі 180 секунд, виключали з досліду. Больовий поріг визначали індивідуально для кожної тварини, по реакції вокалізації у відповідь на електрошкірне подразнення лапок [123].
Дослідження пам'яті проводили по тесту відтворення виробленої УРПУ на 1, 7, 14 та 21 добу після початку опромінення щурів різних вікових груп.
2.3. Визначення кількісних змін вмісту білків проміжних філаментів в різних відділах головного мозку щурів.
Після декапітації тварин вилучали головний мозок, охолоджували і розділяли на відділи. Для дослідження брали по 0,2 г тканини (головний мозок загалом, кора великих півкуль, мозочок, гіпокамп), гомогенізували за допомогою гомогенізатора в 4,5 мл 0,025 М трис-буфера (рН 8,0), що містив 2 мМ ЕДТА, 1 мМ 2-меркаптоетанолу, 0,1 мМ фенілметилсульфонілфториду і соєвий інгибітор трипсина (10 мкг/мл). Гомогенат центрифугували у центрифузі при 30000 g протягом 60 хв. Супернатант (S1) містив розчинну форму білка гліальних філаментів. Осад ресуспендували в 1 мл тієї ж буферної системи, яка додатково містила 4 М сечовину. Супернатант, який отримували після другого центрифугування (S2), містив нерозчинну філаментну форму ГФКБ і триплет білків нейрофіламентів. Кількість білків нейрофіламентів і ГФКБ визначали за допомогою ракетно-лінійного імуноелектрофорезу. Солюбілізовані білки проміжних філаментів мають високу тенденцію до спонтанної агрегації. У зв'язку з цим практично неможливо мати надійні стандартні розчини цих білків і важко виразити результати в абсолютних одиницях (мкг білка). Тому вміст білків нейрональних і гліальних проміжних філаментів виражали в умовних одиницях (пропорційних площам відповідних імунопреципітатів) з розрахунку на 1мг білка відповідної фракції S1 і S2. Вміст загального білка в екстрактах визначали методом Лоурі в модифікації Міллера [157]. Визначення поліпептидного складу проміжних філаментів глії проводили методом імуноблотинга із застосуванням моноспецифічної антисироватки. Контрольна і кожна експериментальна група складалися з 6-ти тварин. Тварини були поділені на групи: 1 - щури отримували одноразову дозу опромінення 0,0129 кл/кг; 2 - щури отримували сумарну дозу опромінення 0,0129 кл/кг протягом 7 днів; 3 - щури отримували цю ж дозу протягом 14 днів; 4 - щури отримували цю ж дозу протягом 21 дня.
Імуноелектрофорез
Кількість білків нейрофіламентів і ГФКБ (гліального фібрілярного кислого білку) визначали за допомогою ракетно-лінійного імуноелектрофорезу. Імуноелектрофорез проводили в 1% агарозному гелі, який готували на трисвероналовому буфері рН 8,6. Розплавлений гель (+550С) заливали на скляні пластинки в такому об'ємі, що відповідає шару геля 0,15 см. Кількість поліклональної моноспецифічної сироватки, яку вносили до геля, визначали експериментально. Електрофорез проводили при наступних умовах: потужність струму дорівнювала 2 В/см, а тривалість експерименту дорівнювала 18 годин. По закінченню електрофореза агарозний гель промивали у забуференому фізрозчині та стискали між фільтрувальним папером три рази, потім пластини геля висушували теплим повітрям. Фарбування проводили 10-15 хвилин розчином 0,5% Кумасі R-250 у етанолі (45%) і оцтовій кислоті (7,5%).
Імуноелектрофорез проводили з використ