РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Вибір об'єкту досліджень
Експерименти було проведено на 279 статевозрілих білих щурах лабораторної лінії "Вістар" обох статей з масою 180-230 г.
Вибір щура як піддослідної тварини був обумовлений такими обставинами. Щури досить активно використовуються в багатьох електрофізіологічних дослідженнях по вивченню основних властивостей периферичної та центральної нервової системи [10,11,45,47,57,114]. Існує багато даних електрофізіологічних, електронномікроскопичних, гістохімічних та морфо-функціональних досліджень, які було отримано саме на щурах [17,42,49,95,96,134,142]. Це дозволяє більш об'єктивно трактувати отримані в наших експериментах результати.
Нервова система білого щура, зокрема, спинний мозок, суттєво не відрізняється від інших представників вищих ссавців, що також робить отримані в результаті нашого електрофізіологічного дослідження дані більш доступними для їх інтерпретації та співставлення. Крім того, існує достатня кількість посібників з морфо-функціональної та біохімічної організації спинного мозку білих щурів.
В експеримент відбирали тих тварин, які відповідали наступним вимогам: по-перше, з відсутністю спонтанних рухів по колу, по-друге, з однаковими вестибулярними рефлексами. У всіх випадках перед гострим дослідом проводили вестибулярні тести, які полягали в наступному:
1) при посадці на поверхню операційного стола тварина повинна була торкатися обома лапами цієї поверхні одночасно;
2) при розташуванні тварини в положенні вниз головою при фіксації за хвіст - пальці задніх кінцівок повинні були бути рівномірно роздвинуті.
Якщо всі ці параметри реалізувалися, то можна було говорити про відсутність ушкоджень нервової системи і тварина вважалася годною для експерименту [11,37].
Використання білих щурів, як піддослідних тварин, дозволило робити більш масові та репрезентативні за кількістю досліди, ніж у інших тварин.
Крім того, у щурів менш тривалий спінальний шок після спіналізації ніж, наприклад, у котів [10,27,98], а також обмінні процеси відрізняються високою інтенсивністю, що важливо, оскільки ми досліджували вплив зміни обмінних процесів на діяльність спинного мозку та нервово-м'язової системи.
2.2. Моделювання гіпертиреоїдного стану
Наявні зараз моделі гіпертиреозу (ГТ) створювалися шляхом годування тварин екстрактом гомогенізованої щитовидної залози - тиреоїдином [21,73]. В цьому препараті, окрім тироксину, вміщуються й інші гормони - трийодтиронін, тирокальцитонін, сполучна тканина [73]. Таким чином, ми не можемо говорити про "чисту" (тироксинову) модель гіпертиреозу, тому зрозуміле наше бажання створити "чисту" модель ГТ без впливів сторонніх, насамперед гормональних, факторів.
Для вирішення цього питання ми використали годування тварин перемеленими таблетками L-тироксину ("Berlin - Chemie AG", Німеччина). Годування проводилося протягом двох тижнів, L-тироксин рівномірно змішували з їжею (всі тварини досліджуваної групи отримували стандартний харчовий раціон). Враховуючи значну інактивацію екзогенного тироксину та посилене його виведення із організму при підвищенні концентрації [73], ми використали зростаючі дози L-тироксину, які застосовували за наступною схемою: на початку годування використовувалася доза препарату, яка була вищою від добової продукції тироксину (в нормі біля 3-5 мкг/добу) в декілька разів, звичайно 10 мкг/добу. Далі щоденно, протягом двох тижнів, нарощували дозу в середньому на 10 мкг/добу, так що під кінець терміну годування тварина отримувала біля 140 мкг L-тироксину на добу.
Через 2 тижні після початку годування щурів L-тироксином визначали за допомогою імуноферментативного методу дослідження концентрацію тетрайодтироніну, трийодтироніну, досліджували особливості серцевої діяльності щурів за допомогою ЕКГ, виміряли вагу щурів, а також визначали особливості поведінки тварин, загальний фізичний стан, оцінювали стан шерсті та шкіряних покровів.
Для визначення вмісту тиреоїдних гормонів в крові використовували імуноферментний метод1. Було визначено вміст трийодтироніну та тетрайодтироніну в сироватці крові завдяки використанню набору реактивів та апаратури фірми Humareader (Німеччина) у інтактних тварин та тварин з двотижневим експериментальним гіпертиреозом [124,214]. У інтактних тварин вміст трийодтироніну (Т3) становив 1,059+0,07 ng/ml, а вже через 2 тижні після початку формування гіпертиреоїдного стану цей показник дорівнював 2,905+0,55 ng/ml, що майже в три рази перевищувало відповідний показник у інтактних тварин. Визначення рівня тетрайодтироніну (Т4) для нашого дослідження мало найбільший інтерес, оскільки для формування гіпертиреозу ми використовували L-тироксин. Результати дослідження рівня Т4 в сироватці крові наведені на рис.2.1.
Рис.2.1. Кількість тетрайодтироніну (Т4 ng/ml) в сироватці крові інтактних тварин (А) та тварин з двотижневим експериментальним гіпертиреозом (Б)
Достовірні зміни позначені зірочкою - * (p<0,05). .
Нами були отримані такі результати по вмісту Т4 в сироватці крові: у інтактних тварин цей показник становив 3,343+0,202 ng/ml і відповідно у тварин з модельним гіпертиреозом 17,14+3,764 ng/ml, що достовірно (p<0,05) підтверджує наявність гіпертиреоїдного стану у тварин і адекватність моделі (див.рис.2.1.).
При візуальному дослідженні щурів було виявлено ознаки, які характерні для ГТ: підвищена агресивність тварин, тремор кінцівок. Тварини приймали характерну "горбату позу". Спостерігалися ознаки екзофтальму. Шерсть тварин становилася тьмяною, місцями випадала.
На протязі експерименту достовірно зменшувалася маса тварин (всі тварини знаходилися на однаковому стандартному харчовому раціоні). Так, якщо прийняти середню масу тварин до годування за 100%, то через 7 днів аналогічний показник становив: 92,08+1,02% (p<0,05), а через 14 днів 89,21+1,33% (p<0,01) - див.рис.2.2.
Рис.2.2. Показники середньої маси інтактних тварин (А), твар