РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Метою досліджень було з'ясування впливу різних джерел азоту і енергетичних субстратів, макро- і мікроелементів на ріст і метаболічну активність мікроорганізмів рубця телят у різному віці в умовах in vitro. Дослідження проведені протягом 1999-2000 рр. у дослідному господарстві Інституту біології тварин УААН "Чишки" на шести телятах чорно-рябої породи в період з 1- до 6-місячного віку, яким у 20-денному віці було накладено фістули на рубець. Телятам згодовували стандартні раціони, до складу яких входили незбиране молоко (до 60-денного віку), комбікорм і сіно лугове. Утримання тварин - стійлове.
Вміст рубця для досліджень від тварин одержували через фістулу за допомогою приладу, який складався з колби Бунзена, приєднаної до металевої трубки і насосу, через 2 години після ранкової годівлі. Відібрані зразки поміщали в попередньо підігріті до 40оС термоси, з метою збереження температури, яка підтримується в середовищі рубця. Вміст фільтрували через 4 шари марлі і фільтрат у кількості 10 мл вносили у інкубаційні флакони з 90 мл буферного розчину Мак Доугля, до складу якого входили (на л): NaHCO3 - 9,8 г; Na2HPO4 - 2,96 г; NaCl - 0,48 г; KCI - 0,58 г; MgSO4 - 0,12 г і CaCI2 - 0,04 г. У дослідні зразки, крім буферного розчину, вносили досліджувані субстрати. Для створення анаеробних умов вміст флаконів продували вуглекислим газом. Вміст інкубували в анаеробних умовах з постійним контролем pH та окисно-відновного потенціалу середовища, при температурі 38оС. Зразки для досліджень відбирали до інкубації і через 6 годин після інкубації. У досліджуваних зразках визначали масу мікроорганізмів рубця, концентрацію аміаку і коротколанцюгових жирних кислот, амілолітичну та целюлолітичну активність. Попередньо досліджували вплив тривалості інкубації - 1, 2, 3, 4, 5 і 6 годин - на ріст мікроорганізмів рубця.
2.1. Дослідження впливу азотових і вуглеводних компонентів на ріст і метаболічну активність змішаної популяції мікроорганізмів рубця телят
Проведено дві серії досліду. У першій серії досліду зразки вмісту рубця телят 1-, 2-, 3-, 4- і 6-місячного віку інкубували за умов додавання до інкубаційного середовища в якості джерела азоту (в еквівалентній за азотом кількості) хлориду амонію (1,6 г/л), сечовини (1,8 г/л), казеїну (2,7 г/л), ріпакової макухи (9,1 г/л), в якості джерела енергії - глюкози, крохмалю, целюлози або ацетату натрію (по 5,4 г/л).
У другій серії досліду до інкубаційного середовища разом з азотовими сполуками додавали глюкозу, а разом із вуглеводами - сечовину у вказаних вище концентраціях. Крім цього, з метою визначення оптимальної для росту мікроорганізмів рубця кількості азоту і енергії, до інкубаційного середовища вносили сечовину і глюкозу в різних співвідношеннях (1:0,25; 1:0,5; 1:0,75; 1:1; 1:1,25; 1:1,5; 1:2,5).
2.2. Дослідження впливу сполук сірки на ріст і метаболічну активність змішаної популяції мікроорганізмів рубця телят
У дослідженнях використовували вміст рубця 6-місячних телят. У буферне середовище при інкубації контрольних і дослідних зразків для забезпечення потреби мікроорганізмів в азоті і енергії вносили глюкозу (5,4 г/л) і сечовину (1,8 г/л). Дослідні зразки інкубували з різними сполуками сірки в перерахунку 0,03; 0,15 і 0,6 ммоль сірки на л інкубаційного середовища, що відповідає мінімальній, оптимальній та максимальній її кількостям для мікроорганізмів рубця [233]. Як джерело неорганічної сірки використовували сульфат амонію і натрієві солі сульфатної, сульфідної і сульфітної кислот, як джерело органічної сірки - d,l-метіонін, цистеїн, цистин, відновлений та окиснений глутатіон. Крім цього, досліджували вплив протекторів SH-груп на ріст мікроорганізмів рубця шляхом додавання до інкубаційного середовища 1 ммоль/л дитіотреітолу.
2.3. Дослідження впливу мікроелементів на ріст і метаболічну активність змішаної популяції мікроорганізмів рубця телят
До інкубаційного середовища додавали рідину рубця, а також різні концентрації (мінімальну, оптимальну і максимальну) молібдату амонію, хлориду хрому, селеніту натрію, хлориду міді, хлориду цинку, хлориду нікелю, хлориду заліза, хлориду кобальту, йодиду калію і хлориду марганцю. Інкубацію проводили в анаеробних умовах протягом 6-ти годин.
2.4. Дослідження впливу сірки разом з іншими мінеральними елементами на ріст і метаболічну активність змішаної популяції мікроорганізмів рубця телят
В інкубаційне середовище на л вносили 0,15 ммоль в перерахунку на сірку сульфату амонію разом з молібдатом амонію (0,05 мкмоль молібдену), селенітом натрію (0,2 мкмоль селену), хлоридом хрому (0,03 мкмоль хрому), хлоридом міді (4 мкмоль міді), хлоридом марганцю (10 мкмоль марганцю), хлоридом кобальту (0,1 мкмоль кобальту). Зразки інкубували протягом 6-ти годин в анаеробних умовах.
2.5. Дослідження впливу акцепторів водню на ріст і метаболічну активність мікроорганізмів рубця телят
В інкубаційне середовище вносили акцептори водню в концентраціях, які не проявляли інгібуючого впливу на ріст мікроорганізмів. Так, на л інкубаційного середовища, крім сульфату натрію (0,2 ммоль сірки), із акцепторів водню використовували: окиснений глутатіон (1 ммоль), натрієві солі лінолевої і фумарової кислот (по 1 ммоль), хромат натрію і хлорид хрому (по 0,05 мкмоль хрому). Крім цього, враховуючи специфічну роль нікелю в коферментах метаногенних бактерій [277], як важливих споживачів водню в рубці, до інкубаційного середовища разом з акцепторами водню додавали хлорид нікелю (0,4 мкмоль нікелю/л).
2.6. Дослідження вивільнення неорганічних фосфатів із фітинової кислоти фітазою мікроорганізмів рубця телят
У рідині рубця визначали концентрацію загального, органічного, неорганічного фосфору і фосфору фітинової кислоти, а також активність фітази. Крім цього, in vitro досліджували вплив доданої до інкубованих зразків вмісту рубця окремо фітинової кислоти (1 г/л) або фітинової кислоти разом з глюк