РОЗДІЛ 2
МЕТОДИ І ОБ'ЄКТ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Вiдбiр тварин для дослідження
Дослiди виконані на лабораторних безпородних білих щурах-самцях масою тiла 180-200 г, якi утримувалися на стандартному рацiонi вiварiю. У процесі роботи всього використано 198 тварин.
Моделлю токсичного ураження печінки служила інтоксикація тварин аліловим спиртом, який вводили внутрішньочеревно одноразово в дозі
30 мг/кг [153]. Всі піддослідні тварини було поділено на такі групи:
І - інтактні тварини, яким вводили фізіологічний розчин;
ІІ - тварини, що отримували аліловй спирт (контроль);
ІІІ - щурі, що отримували аліловй спирт, а також донор оксиду азоту L-аргінін;
ІV - щурі, що отримували аліловй спирт, а також донор оксиду азоту
(+-)-(Е)-етил-2-[(Е)гідроксиіміно]-5-нітро-3-гексенамід (FK409);
V - тварини з гепатитом, яким вводили неселективний інгібітор NO-синтази метиловий ефір N-нітро-L-аргінін (L-NAME);
VI - уражені токсином щурі, яким вводили селективний інгібітор індуцибельної NO-синтази - N-(3-(амінометил)бензил)ацетамідин (1400W);
VIІ - тварини з корекцією токсичного гепатиту, викликаного аліловим спиртом, за допомогою поєднаного застосування селективного інгібітора індуцибельної NO-синтази 1400W і субстрату синтази оксиду азоту L-аргініну.
L-аргінін ("Sigma", USA) вводили в дозі 0,2 г/кг протягом 15 днів перед призначенням алілового спирту, в день інтоксикації і в наступні дні, включно з днем декапітації тварин [277]. FK409 ("Sigma", USA) вводили одноразово орально в дозі 10 мг/кг маси щура за 30 хв до інтоксикації і дворазово на наступний день після інтоксикації [273]. L-NAME ("Sigma", USA) вводили внутрішньочеревно в дозі 10 мг/кг за 30 хв перед токсичним ураженням і на наступний день після інтоксикації. [243] і 1400W("Sigma", USA) - вводили одноразово внутрішньочеревно за 30 хв до ін'єкції гепатотоксину у дозі 1,5 мг/кг і дворазово на наступний день після інтоксикації в аналогічній дозі. [181].
Щурів декапітували під топентал-натрієвим наркозом через 24 год і 72 год з моменту інтоксикації. У дослідженні використовували тканину печінки і кров.
Усі експерименти на тваринах проводили у відповідності з "Правилами використання лабораторних експериментальних тварин" [106].
2.2. Визначення загальної концентрації білка у плазмі крові та печінці білих щурів
Білок реагує з сірчанокислою міддю в лужному середовищі з утворенням сполук синього забарвлення (біуретова рекція). Інтенсивність забарвлення розчину прямо пропорційна концентрації білка в сироватці [34]. Для дослідження готували дослідну і холосту проби. До 0,08 мл плазми крові, гомогенату печінки або суспензії мітохондрій додавали 4 мл біуретового реактиву; у холосту пробу замість біологічного матеріалу вносили 0,08 мл фізіологічного розчину, змішували, витримували 30 хв при кімнатній температурі й вимірювали оптичну щільність дослідної проби проти холостої на спектрофотометрі СФ-46 при довжині хвилі 550 нм. Розрахунки здійснювали за допомогою побудованого з використанням сироватки альбуміну.
2.3. Визначення концентрації NO, вмісту нітратів і нітритів та сумарної активності NO-синтази
NO в тканинах печінки визначали електрохімічним методом [165]. Робочий електрод (наносенсор) для визначення NO готували, як описано [224]. Наносенсор являв собою карбонове волокно діаметром приблизно 500 нм, один кінець якого покритий нікель(ІІ)-тетракіс(3-метокси-4-гідрокси-феніл) порфіриновою полімерною плівкою. Вимірювання проводили за допомогою трьохелектродної системи, що складалася з наносенсора (робочий електрод), платинового вимірювального електрода і каломельного електрода порівняння.
Після декапітації тварин печінку негайно видаляли, поміщали у холодний розчин Хенкса, розрізали на декілька шматочків і відразу поміщали у рідкий азот. У такому стані тканини печінки зберігали не більше 20 днів до їх використання. Безпосередньо перед визначенням вмісту NO шматочки печінки поміщали у холодний розчин Хенкса і тканину нарізали тоненькими смужками довжиною 7-8 мм і шириною 4-5 мм. Смужку тканини печінки поміщали на дно термостатованої кювети (37 oC), заповненої фосфатним буфером. Платиновий і каломельний електроди розміщували в кюветі близько до тканини печінки, а активний кінець робочого наносенсора опускали на поверхню тканини за допомогою мікроманіпулятора. Щоб оцінити максимальну продукцію NO, 10 мкл іонофору кальцію A23187 (рецептор-незалежний агоніст ендотеліальної NO-синтази) наносили на поверхню тканини печінки за допомогою наноінджектора (кінцева концентрація іонофору в середовищі 1 мкмоль/л). Записували величину струму, що виникав внаслідок окиснення NO на робочому електроді. Для цього використовували мультиканальний потенціостат PAR, модель 273 (EG&G Princeton Applied Research). При оптимальному потенціалі для окиснення NO (0,65 V) величина струму була прямопропорційною до концентрації NO у безпосередній близькості до робочого наносенсора. Отримані дані обробляли за допомогою комп'ютерної програми (Research Electrochemistry Software, Ver. 4.30; EG&G Princeton Applied Research) і аналізували за допомогою програми Origin 6.0. Рівень NO розраховували використовуючи калібрувальну криву (до і після вимірювання наносенсор калібрували, використовуючи стандартний розчин нітрит натрію).
Даний метод дозволяє визначити концентрацію NO in situ. Поріг чутливості наносенсора становить приблизно 1 нмоль/л. Оскільки індуцибельна NO-синтаза нечутлива до зміни концентрації іонів кальцію, за допомогою даного метода можна оцінювати функціональний стан конституційної NO-синтази (еNOS), яка в печінці знаходиться, в основному, в ендотеліоцитах мікрокапілярів та синусоїдів.
Визначення сумарної активності синтази оксиду азоту. Сумарну активність NO-синтази печінки визначали колориметрично за кількістю утворених нітратів і нітритів в інкубаційному середовищі, що містило Тріс- HCl буфер, pH 7,9 з молярною концентрацією 40 ммоль/л, гомогенат печ