РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Відбір тварин для дослідження
Досліди проведені на білих щурах-самцях лінії Вістар, яких утримували на стандартному раціоні віварію. Для вивчення використовували щурів трьох вікових періодів: статевого дозрівання (3-місячні тварини), статевої зрілості (6-місячні тварини) та старіння (18-місячні тварини).
Кадмієвий токсикоз викликали шляхом внутрішньочеревинного введення хлориду кадмію, який попередньо розводили на 0,9 % розчині хлориду натрію, з розрахунку 7 мг/кг маси тіла тварини, що становить 1/12 DL50 [45]. Інтактним тваринам внутрішньочеревинно вводили відповідну кількість 0,9 % розчину хлориду натрію.
Всі піддослідні тварини були поділені на такі групи: 1-інтактні щури; 2-щури, уражені хлоридом кадмію; 3-щури, яким для корекції кадмієвої інтоксикації вводили прополіс; 4-щури, яким для корекції кадмієвої інтоксикації вводили комбінацію прополісу і ентеросорбенту "Фібрабет"; 5-щури, яким для корекції кадмієвої інтоксикації вводили комплекс антиоксидантів, інкапсульованих в ліпосоми. В кожній групі по 6 тварин (n=6). Тварин декапітували під легким ефірним наркозом на 1-у, 4-у, 7-у та 14-у доби з моменту інтоксикації.
Прополіс, виготовлений згідно з методикою П.А. Кравчук (1982), вводили з розрахунку 0,25 г/кг маси тіла у вигляді 10 % спиртового розчину перорально за допомогою зонда через 24 год після введення хлориду кадмію протягом усього досліду щоденно [33]. Контрольній групі тварин вводили відповідну кількість 70 % розчину етилового спирту. Ентеросорбент "Фібрабет"- біологічно активний додаток (отриманий на кафедрі медичної хімії Тернопільської державної медичної академії і затверджений МОЗ України) давали тваринам із розрахунку 1 г/кг маси тіла за допомогою зонда щоденно протягом усього експерименту через 24 год після введення прополісу. Суспензію холінофосфатидних ліпосом вводили внутрішньочеревинно у дозі 0,1 г/кг маси тіла протягом всього досліду щоденно [75].
Експерименти на тваринах проводили із дотримуванням часу доби.
Об'єктами дослідження були сироватка крові та гомогенат печінки.
Дослідження стану ендогенної інтоксикації
Визначення вмісту середніх молекул
Визначення СМ проводили згідно методики [147], в модифікації [129]. З сироватки крові виділяли кислоторозчинну фракцію, яку отримували шляхом додавання до 0,2 мл сироватки 1,8 мл 10 % розчину трихлороцтової кислоти. Наступне центрифугування проводили при 3000 об./хв на протязі 30 хв. Виділену фракцію в об'ємі 0,5 мл розводили дистильованою водою у співвідношенні 1:10 і визначали оптичну густину при довжині хвилі 254 нм (визначаються ланцюгові амінокислоти) та 280 нм (визначаються ароматичні амінокислоти) проти дистильованої води на спектрофотометрі СФ-46; результати виражали в одиницях, чисельно рівних показникам екстинкції.
Визначення еритроцитарного індексу інтоксикації
ЕІІ визначали за методом [145]. В основі методу лежать уявлення про еритроцит як універсальний адсорбент. В пробірку, яка містила 1 мл 3,8 % розчину цитрату натрію, відбирали 4 мл крові, перемішували і відділяли еритроцити шляхом центрифугування на протязі 10 хв при 3000 об./хв. Плазму видаляли. 1мл еритроцитарної маси переносили в пробірку, яка містила 3 мл розчину метиленового синього (0,025 % ), приготовленого на фізіологічному розчині. Перемішували і інкубували на протязі 10-12 хв при кімнатній температурі. Дальше центрифугували на протязі 10 хв при 3000 об./хв. Надосадову рідину переносили в кювету фотоелектроколориметра. Визначали оптичну густину вихідного розчину і надосадової рідини в одиницях екстинкції колориметричним методом по відношенню до фізіологічного розчину при довжині хвилі 630 нм.
Кількість поглинутого барвника (у відсотках) вираховують за такою формулою:
А = 100 - С100/В, (2.1)
де А - кількість поглинутого барвника, %;
В - оптична густина вихідного розчину, ум. од. екстинкції;
С - оптична густина розчину барвника після інкубації з еритроцитами ум. од. екстинкції.
Визначення активності аланін- і аспартатамінотрансфераз
Для визначення активності аланін- і аспартатамінотрансфераз використовували метод Райтмана і Френкеля [41], який базується на здатності 2,4-динітрофенілгідразину в лужному середовищі утворювати забарвлений гідразон піровиноградної кислоти, за інтенсивністю якого судять про активність амінотрансфераз.
Для дослідження брали 0,1 мл сироватки крові або 10 % -ного гомогенату. В пробірки наливали по 0,5 мл відповідного субстрату і суміш інкубували 30 хв для АлАТ і 60 хв для АсАт при температурі 37 0С. Після інкубації додавали 0,5 мл 2,4-диніторфенілгідразину і витримували 20 хв при кімнатній температурі. Припиняли реакцію внесенням в пробу 5 мл розчину NaOH з молярною концентрацією 0,4 моль/л. Через 15 хв проби колориметрували при 545 нм в кюветі 10 мм, проти холостої проби. Холосту пробу готували аналогічно дослідним, але сироватку (гомогенат) вносили після інкубації.
Розрахунок активності ферменту проводили за допомогою калібрувального графіку, побудованого для піровинограднокислого натрію і виражали в мкмолях піровиноградної кислоти на 1 г білка крові або печінки за 1 год інкубації.
Визначення активності кислої фосфатази
Для вивчення активності кислої фосфатази користувалися методом Боданского [41]. Принцип методу базується на здатності бета-гліцерофосфату в кислому середовищі взаємодіяти з молібденовокислим амонієм і аскорбіновою кислотою. В результаті утворюється неорганічний фосфат, за вмістом якого можна судити про активність кислої фосфатази.
Для визначення використовували 0,1 мл сироватки крові або 0,1 мл 10 % гомогенату. Додавали 1 мл кислого розчину бета-гліцерофосфату і інкубували на протязі 1 год при температурі 37 0С. Після інкубування білок осаджували, додаючи до проби 1 мл 10 % трихлороцтової кислоти. Осад відділяли центрифугуванням протягом 10 хв п