Розділ 2.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
2.1. Матеріали
Білки, пептиди та моноклональні антитіла- фібриноген людини, плазмін та тромбін
купували у Enzyme Research Laboratories (South Bend, США). Фрагменти
фібриногену D100 (мол маса 100000 Да) та D98 (мол маса 98000 Дa) отримували
обробкою фібриногену плазміном та очищали як показано раніше [129, 130].
Пептид, що дуплікує послідовність фібриногену g365-383, NGIIWATWKTRWYSMKKTT
(Р3), та серію пептидів, що часткого повторюють цю послідовність (g365-383,
g365-377, g370-380, g373-385, g373-383, g370-380), пептид KMTATKSWRTYTKW (Р3’),
були синтезовані за допомогою Fmoc методу та очищені за допомогою HPLC на
препаративний колонці C18 Vydac при використанні лінійного градієнту
ацетонітрилу у 0,1% трифлуоресцентній кислоті. Наявність та чистота петидів
визначалась за допомогою масс спектрометрії. Також були синтезовані
додекапептид g400-411 (Н12), пептиди, що дуплікують g340-357, g351-370,
g383-395 фібриногену (Н19, Н20 та Р2-С відповідно) та ШCS-1 пептид
фібронектина, були охарактеризовані раніше [131, 132].
Антитіла до різних інтегринових субодиниць купували у Chemicon International
(Temecula, США): anti-b1 mAb 1965 (clone JB1A), anti-b1 mAb 1957z (clone
25E11), anti-a5b1 mAb 1969 (clone JBS5), anti-a5 mAb 1956z (clone P1D6),
anti-av mAb 2021z (clone AV1), anti-avb3 mAb 1976z (LM609), anti-a2b1 mAb 1998
(clone BHA2.1), та поліклональне антитіло до інтегрину a5, 1928, проти
цитоплазматичного хвоста. MAb CD41 проти aIIbb3 були придбані у Immunotech
(Marseille, France). MAb GTI-N4P (clone AP3) проти aIIbb3 були від GTI
(Brookfield, США). Хімерний Fab 7E3 (abciximAb), що пізнає інтегрини aIIbb3 and
avb3 були подарунком від Dr. B. Coller (Rockefeller University, США). MAbs 4F10
and 2G12 проти aIIbb3 були від Dr. V. Woods (University of California, San
Diego, США). MAb 1413 (clone R7.1), що впізнають aL субодиницю лейкоцитарного
інтегрину aLb2, mAb w6/32 проти MHC клас I та очищений IgG були використані як
контролі. Анті-фібриногенові mAbs були mAb 2G5, mAb 3G11, mAb 2F10, mAb 4-2 та
mAb 4A5. MAb 2G5 було зроблено шляхом імунізації миши фрагментом DD людини та
впізнає послідовність у фібриногені g373-385 [133]. MAbs 3G11 та 2F10 є
кросс-компетентними з mAb 2G5, що може означати, що вони впізнають епітопи
всередині gC поблизу g365-383 [134]. Mab 4-2 впізнає послідовність фібриногені
g390-402 [135]. MAb 4A5 впізнає C-термінальну ділянку gC, g406-411 [136] були
подарунком від Dr. G. Matsueda (Bristol-Meyers Squibb).
Синтез пептидів проводили на целюлозній мембрані Whatman 50 (Whatman,
Великобританія). Диметилформамід (ДМФ), дихлорметан, метанол були отримані від
фірми Fisher (США); диізопропілкарбодіімід, трифтороцтова кислота (ТФО), - з
фірми Advanced ChemTech (США); N-метилімідазол, N,N-диізопропілетиламін
купували у фірми Applied Biosystems (США); бромфенол - у компанії Bio-RAD
(США); ацетангідрид, N-метилпіролідон, триізобутилсілан одержали від фірми
Fluka (США); піперидин, фенол та бичачий сироваточний альбумін (БСА) - з
компанії Sigma (США); реагент Iodogen для іодизації був з фірми Pierce (США),
Calcein AM був отриманий від Molecular Probes (США). Fmoc-АК-ОPfp (всі
амінокислоти з захисною групою 9-флуоренілметоксикарбоніл та активовані
пентафлуорофенілом) були одержані від Bachem (США). Для захисту бічних ланцюгів
були використані : тритил для Cys, His, N, Gln; t-бутил для Asp, Glu, Ser, Thr;
t-бутоксікарбоніл для Lys, Trp; та пентаметилхроман сульфоніл для Arg.
Fmoc-b-alanine-OH (Bachem, США).
Також у роботі було використано трис[гідроксиметил]-амінометан та
фенілметилсульфонілфторид (PMSF) від Sigma (США), b-меркаптоетанол та TEMED від
Bio-Rad (США), маркери білків (Invitrogen, США). Решта реактивів ступеню
чистоти «хч» чи вище.
2.2. Препаративні методи
2.2.1. Виділення та очищення інтегрину aIIbb3
Інтегрин aIIbb3 виділяли з тромбоцитів, а саме з тритонового екстракту
тромбоцитарних мембран, двома послідовними хроматографіями на
конковалін-сефарозі та Mono-Q сефарозі [137]. Тромбоцити вилучували з
тромбоцитарного концентрату. Для видалення еритроцитів тромбоцитарну масу
центрифугували при 300g 5 хвилин. Одержаний супернатант центрифугували 15
хвилин при 1800g, в осаді якого отримували фракцію тромбоцитів. Для очистки
плазми від білків, які адсорбувалися на поверхні тромбоцитів, тромбоцити
промивали 20мМ Трис-HCl буфером, pH 7,4, що містив 150 мМ NaCl, 2мМ EDTA, 2мМ
EGTA, та 2мМ бензамідина і знову центрифугували 15 хвилин при 1800g. Цю
процедуру повторювали тричі. Всі процеси центрифугування здійснювали при +4оС.
Очищені тромбоцити суспендували в 20 мМ трис-HCl буфері, pH 7,4, що містив 4мМ
Са2+ і руйнували їх на ультрозвуковому дезінтеграторі. Фракцію мембран
отримували центрифугуванням при 40000 протягом 80 хв. Тромбоцитарні мембрани,
отримані з зруйнованих ультразвуком тромбоцитів, обробляли 2% тритоном Х-100
протягом ночі при перемішуванні при +4оС. Отриманий препарат перевіряли
електрофоретично на відсутність домішків. Заморожували та зберігали при –20оС.
2.2.2. Експресія рекомбінантних білків
Рекомбінантні домени gC були експресовані у розчиненому вигляді з GST [138].
cDNA, що кодує повністю g ланцюг людського фібриногену була надана др С.Т.Лорд
(Університет Північної Кароліни). Ділянка, що кодує gC домени дикого типу
(амінокислотні залишки Ile145- Val411) була ампліфікована за допомогою
полімеризаційної ланцюгової реакції при використанні р674 [139] як матриці.
Праймери, що були використані для отримання gС-доменів були такі
5'-GGAA
- Київ+380960830922