розділ 2.17). Підтримуваний потенціал становив –55 мВ. Після
прориву мембрани нейрон перфузували внутрішньопіпетковим розчином на протязі
3-х хв до початку стимуляції. Струм викликали ступінчатою деполяризацією
мембрани клітини до 0 мВ тривалістю 50 мс. Після досягнення струмом
максимального рівня до зовнішнього розчину додавали латротоксинподібний білок в
концентрації 10 мкг/мл. Це викликало збільшення кальцієвого струму L-типу в
середньому на 33 ± 5 %, яке повністю усувалося при відмиванні білка із
зовнішнього розчину (n=4) (рис.3.24 А, рис.3.25).
Також було досліджено вплив латротоксинподібного білка на вольт-амперну
характеристику кальцієвих каналів L-типу, яку отримували при ступінчатій
деполяризації мембрани нейронів від підтримуваного потенціалу –55 мВ до різних
рівнів з інкрементом 10 мВ, тривалістю 50 мс. На рис. 3.24 Б представлено
узагальнену вольт-амперну характеристику для кальцієвих каналів L-типу нейронів
гіпокампу щурів в контролі (1), при дії латротоксинподібного білка в
концентрації 10 мкг/мл (2) та при відмиві білка із зовнішнього розчину (3; у
всіх випадках n=4).
Рис.3.24. Вплив латротоксинподібного білка на роботу L-типу кальцієвих
каналів.
А) типова реєстрація кальцієвого струму L-типу в контрполі(1), під дією
латротоксинподібного білка(2), та при відмиванні латротоксинподібного білка з
зовнішнього розчину(3).
Б) криві вольтамперної характеристики кальцієвого струму L-типу в контрполі(1),
під дією латротоксинподібного білка(2), та при відмиванні латротоксинподібного
білка з зовнішнього розчину(3).
Рис. 3.25 Узагальнені значення амплітуди кальцієвого струму L-типу в
контрполі(1), під дією латротоксинподібного білка(2), та при відмиванні
латротоксинподібного білка з зовнішнього розчину(3).
Таким чином, отримані нами результати свідчать про те, що за умов прикладання
латротоксинподібного білка на L-тип кальцієвого струму також спостерігається
збільшення амплітуди, а кінетичні та потенціалзалежні характеристики струму
залишаються незмінними.
3.5. Дослідження впливу латротоксинподібного білка на спонтанні постсинаптичні
відповіді.
Дані, отримані нами в вищезгаданих дослідженнях, свідчать про те, що
латротоксинподібний білок має властивості, які значно розширюють можливу
область його дії. І таким чином, ймовірно, що функції латротоксинподібного
білка не обмежуються лише опосередковуванням процесу злиття мембран. А отримані
нами результати щодо впливу на роботу кальцієвих каналів, дають змогу
припустити, що прикладання латротоксинподібного білка може впливати на
ініціацію вивільнення нейромедіатора. Тому нам здалося доречним дослідити, чи
буде латротоксинподібний білок виявляти вплив на спонтанні постсинаптичні
відповіді. Дослідження впливу латротоксинподібного білка на спонтанні
постсинаптичні струми досліджували на клітинах культури нейронів гіпокампа.
Для виділення гальмівних спонтанних постсинаптичних струмів, до зовнішнього
розчину додавали 10 µM CNQX and 50 µM APV, для блокування іонотропних
глутаматних рецепторів. Для дослідження спонтанного вивільнення нейромедіатора,
який не був викликаний проходженням потенціалів дії, була досліджена спонтанна
гальмівна активність в умовах блокування натрієвих каналів за допомогою 1 мкМ
ТТХ (“мініатюрна активність“) (Рис. 3.26, 3.27 А)
Рис. 3.26. Гальмівні спонтанні постсинаптичні струми в нейронах культури
гіпокампа щура в контролі (реестрація А) та під дією 0,3 мкМ
латротоксинподібного білка (реєстрація В).
За таких умов в контролі спостерігалась незначна спонтанна активність, частота
якої становила близько 0,37 ± 0,07 Гц (n=3)(Рис. 3.27, 3.28 А,Б). Аплікація 0,3
мкМ латротоксинподібного білка призводила до значного зростання частоти
спонтанної активності, яка становила близько 3,8 ± 0,45 Гц (n=3)(Рис. 3.28
А,Б).
Рис. 3.27. а) Частотно-амплітудний розподіл спонтанних постсинаптичних
відповідей в контролі та під дією латротоксинподібного білка.
б)Частотний розподіл спонтанних постсинаптичних відповідей в контролі та під
дією латротоксин-подібного білка.
На рисунку 3.27 представлений частотно-амплітудний розподіл спонтанних
постсинаптичних відповідей в контролі та під дією 0,3 мкМ латротоксинподібного
білка. Як видно з рисунку, додавання латротоксинподібного білка викликало
миттєве зростання частоти спонтанних постсинаптичних відповідей, яке дещо
спадало з часом. В середньому, зростання частоти спонтанних відповедей
відбувалося майже в 10 разів(Рис. 3.27 Б, 3.28 А). При цьому також відбувалося
деяке зростання їх амплітуди, яке становило близько 144,63 ± 24,56% (рис. 3.28
Б).
Рис. 3.28 Дослідження впливу латротоксинподібного білка на частоту (А) та
амплітуду (Б) спонтанних постсинаптичних потенціалів в культурі нейронів
гіпокампа.
Таким чином, отримані нами результати свідчать про те, що латротоксинподібний
білок здатен викликати спонтанне вивільнення нейромедіатора, яке виражається в
зростанні частоти та амплітуди спонтанних постсинаптичних відповідей.
ОБГОВОРЕННЯ
З літературних даних відомо, що в пресинаптичному закінченні є певна кількість
білків,
які виконують роль посередників в процесі злиття мембран[232;233;234;235;236].
Це білки так званої родини ААА АТФаз - NSF, що опосередковує злиття мембран
синаптичних везикул з цитоплазматичними мембранами; р97 – посередник злиття
мембран в апараті Гольджі та ендоплазматичному ретикулюмі, та
інші[237;233;238]. Їх основна роль полягає в тому, що вони забезпечують
дисоціацію білкового SNARE комплексу, який зв‘язує мембрани синаптичних везикул
з пресинаптичними мембранами в
- Київ+380960830922