РАЗДЕЛ II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Њ вҐаЁ «л Ёбб«Ґ¤®ў Ёп
Њ вҐаЁ «®¬ Ёбб«Ґ¤®ў Ё© Ўл«® §аҐ«®Ґ зерно сорго (Sorghum) сортов Зетра-83,
Судзерн-62, Сахарное ДНВ-45, Стрелец-68, Степной-5, и веничное Карликовое-45, а
также зрелое зерно кукурузы (Zea mais L.) гибрида Пионер 3983, линий кукурузы
ДЛ 300, ДЛ 308, ДЛ 309, различающиеся по устойчивости к Fusarium moniliforme
[93], выращенных в Днепропетровском институте зернового хозяйства УААН.
2.2. Экстракция поверхностных липидов и схема исследований
Эстракцию проводили по [127]. Навеска зерна, 1000 шт зерновок, обрабатывалась
очищенным и перегнанным кипящим хлороформом в соотношении 1:2 по объему.
Экстракцию проводили в течение 30 сек., трижды. Объединенные экстракты сушили
прокаленным Na2SO4 при 200С в течение 2 часов. Экстракт фильтровали, осадок на
фильтре промывали свежеперегнанным хлороформом, упаривали на роторном
испарителе или в токе азота и получали суммарную фракцию. Взвешивали. В
дальнейшем следовали ниже представленной комплексной схеме исследований, либо в
зависимости от поставленной цели выбирали одно из направлений исследования
согласно схеме.
Суммарные ПЛ
Получение 2,4-ДНФГ- Дифференциальный производных температурный
анализ
Тонкослойная Гидролиз Спектральные Газо-жидкостная
хроматография исследования хроматография
углеводородов
Реэкстракция
Жирные кислоты
(ГЖХ метиловых эфиров)
2.3. Тонкослойная хроматография
Тонкослойную хроматографию проводили по [25] на пластинках “Silufol” (Чехия)
восходящим способом в системе растворителей петролейный эфир - диэтиловый эфир
- ледяная уксусная кислота (90: 10: 3 по объему) при комнатной температуре .
Хроматограмму проявляли парами иода, который окрашивал липиды в желтый цвет по
[137]. Для идентификации отдельных фракций липидов использовали величину Rf.
Величины полученные в эксперименте, сравнивали с литературными данными [5, 6] с
учетом системы растворителей. Хроматографическую подвижность липидов опытных
образцов сравнивали с таковой для чистых веществ.
2.4. Спектральные исследования
Спектры поглощения в УФ-области снимали в гексановых растворах на спектрометре
Speсord M-40 (Германия) в 0.2; 0.5 или 1-сантиметровых кюветах, концентрация
растворов 0.013-0.3% Инфракрасные спектры изучали на спектрометре Speсord UR-20
в виде суспензии вещества в вазелиновом масле на оптическом стекле из бромида
кальция.
2.5. Газо-хроматографический анализ углеводородов
Углеводороды анализировали в экстрактах после упаривания аликвоты на
газо-жидкостном хроматографе "Сhrom-5"(ЧССР), оснащенном пламенно-ионизационным
детектором. Использовали стекляную спиральную колонку размером 2.5 м х 0.4 см,
заполненную 5% SP- 2100 на Chromaton N-Super 80-100 меш. Температура детектора
и введения пробы 2500 С, температура термостата программировалась от 1500 до
2500 С со скоростью 50С/мин. Скорость газа-носителя (гелия) 40 мл/мин.
Идентификацию проводили сравнительно с временем удерживания метки
маркера-н-доктриоконтанола, который является превалирующим компонентом ПЛ
листьев 5-10-дневных проростков кукурузы. Количество компонентов измеряли по
доле площади каждого пика в сумме площадей всех компонентов, в %.
Также использовали хроматограф Цвет-100 (СССР), снабженный
пламенно-ионизационной детекцией (ПИД), и стеклянной спиральной капиллярной
колонкой размером 100мх33мм, наполненной неподвижной фазой SЕ-30 (Чехия).
Работа хроматографа осуществлялась в изотермическом режиме при температуре
термостата 300 °С. Скорость газо-носителя азота марки ОВЧ составляла 60 мл/мин,
водород марки ОВЧ-30 мл/мин, воздух марки ВЧ-300 мл/мин. Температура камеры
испарения составляла 350°С, детектора ПИД-360°С. Величина потока
пламенно-ионизационной детекции составляла 50 х10-12А (граница измерения).
Объем пробы, которая помещалась в камеру, составлял 0,5мкл. Идентификацию
компонентов проводили сравнительно с временем удержания меток
маркеров-стандартов (аутентичные вещества производства фирмы Меrсk (Германия).
Для дополнительной идентификации веществ величина времени удержания компонентов
сравнивалась с величинами, полученными из уравнения корреляции между значениями
времени удержания и длиною углеводной цепи компонентов. Количественный анализ
хроматограмм проводили путем измерения доли каждого компонента в сумме площадей
всех компонентов, в %.
2.6. Гидролиз суммарных ПЛ и реэкстракция
Гидролиз суммарных ПЛ, реэкстракция и получение двух липидных фракций -
неомыляемых веществ и жирных кислот - проводили по [105]. К 0,5-0,7 г сухих
суммарных ПЛ прибавляли 5 мл 0,3 N раствора NaOH в метаноле (этаноле) и
кипятили с обратным холодильником в течение 2 часов. После охлаждения к смеси
добавляли 2 мл 90% метанола (этанола) и смесь экстрагировали очищенным гексаном
в отношении 1:1 трижды, на делительной воронке. В объединенных гексановых
экстрактах содержатся неомыляемые вещества, которые далее могут быть
исследованы. В нижний водно-метанольный слой в тех же делительных воронках
добавляли 0,3 мл 6 N соляной кислоты и экстрагировали трижды хлороформом в
отношении 1:1, собирая каждый раз нижний хлороформный слой. Объединенные
хлороформные экстракты сушили на холоду над Na2SO4 в течение 12 часов.
Фильтровали, упаривали досуха и метилировали для газо-хроматографического
анализа.
2.7. Синтез нитрозометилмочевины, приготовление раствор