РОЗДІЛ 2
Матеріали і методи досліджень
2.1. Штами дріжджів, культивування і техніка проведення експериментів
Штами. В роботі були використані наступні штами дріжджів Saccharomyces
cerevisiae: YPH250 (MATa trp1-Д1 his3-Д200 lys2-801 leu2-Д1 ade2-101 ura3-52) –
дикий чи батьківський; YTT7 (MATa trp1-Д1 his3-Д200 lys2-801 leu2-Д1 ade2-101
ctt1::URA3), дефектний за цитозольною каталазою; YIT2 (MATa his3-Д200 lys2-801
leu2-Д1 ade2-101 ura3-52 cta1::TRP1), дефектний за пероксисомальною каталазою;
YWT1 (MATa his3-Д200 lys2-801 leu2-Д1 ade2-101 ctt1::URA3 cta1::TRP1),
дефектний за цитозольною та пероксисомальною каталазами. Деталі щодо генетичних
дефектів штамів подано в таблиці 2.1. Штами були люб’язно надані доктором Й.
Інуї (Інститут сільського господарства, Відділ прикладної біології, Кіото)
[68].
Таблиця 2.1.
Генетичні дефекти штамів, використаних
у роботі (складено на основі [3])
Назва гену
Фермент, який кодується даним геном
TRP1
N-(5?-фосфорибозил)-антранілатізомераза (КФ 5.3.1.24)
HIS3
Імідазолгліцерофосфатдегідратаза (КФ 4.2.1.19)
ADE2
Фосфорибозиламіноімідазолкарбоксилаза (КФ 4.1.1.21)
LYS2
Дегідрогеназа аміноадипінового напівальдегіду (КФ 1.2.1.31)
LEU2
3-ізопропілмалатдегідрогеназа (КФ 1.1.1.85)
URA3
Оротидин-5?-фосфатдекарбоксилаза (КФ 4.1.1.23)
CTA1
Пероксисомальна каталаза, або каталаза А (КФ 1.11.1.6)
CTT1
Цитозольна каталаза, або каталаза Т (КФ 1.11.1.6)
Штам YPH250 (MATa trp1-Д1 his 3-Д200 lys2-801 leu2-Д1 ade2-101 ura3-52)
зберігається в Центрі генетики дріжджів Каліфорнійського університету в Берклі
(Каліфорнія, США), звідки він був отриманий Й. Інуї. Ізогенні мутантні штами –
YTT7, YIT2 і YWT1, сконструйовані Й. Інуї зі співробітниками [68]. Штам YTT7
має такий самий генотип, як і штам YPH250, але у нього в локус гену CTT1, який
кодує цитозольну каталазу, інтегровано ген URA3. Отже, штам YTT7 на відміну від
батьківського штаму YPH250 не синтезує цитозольної каталази, однак здатний
синтезувати оротидин-5?-фосфатдекарбоксилазу, тому не є ауксотрофом за
урацилом. У штаму YIT2 в локус гену CTA1, який кодує пероксисомальну каталазу,
інтегровано ген TRP1, який кодує N-(5?-фосфорибозил)-антранілатізомеразу. Цей
штам не має ауксотрофії за триптофаном, проте не здатний синтезувати
пероксисомальну каталазу. Штам YWT1, дефектний за двома каталазами, отриманий
при схрещуванні клітин штамів YTT7 і YIT2 з наступною селекцією гаплоїдних
клітин.
Реактиви. В роботі використовували дріжджовий екстракт («BioGene», Англія),
фенілметилсульфонілфторид (ФМСФ), бутилгідрокситолуол (іонол), глюкозо-6-фосфат
натрію (Г6Ф), АМФ, семиводний сульфат заліза (II), диметилсульфоксид (ДМСО) і
манітол фірми «Sigma Chemical Co.» (США); N,N,Nґ,Nґ-тетраметилетилендиамін
(ТЕМЕД), НАДФН, НАДФ, АДФ, АТФ, НАД, окиснений глутатіон, гідрохлорид
гістидину, 3-аміно-1,2,4-триазол («Reanal», Угорщина), гуанідин-гідрохлорид
(«Fluka», Німеччина). Решта реактивів – вітчизняного виробництва класу не нижче
ч. д. а.
Оцінка виживання клітин. В дослідах, де оцінювали виживання дріжджів, клітини
досліджуваного штаму S. cerevisiae вирощували в нічний культурі протягом 18
годин. На 1 мл нічної культури засівали приблизно 20000 клітин. Для цього
частинку штриха з культур на скошеному агарі переносили петлею у 3 мл
стерильної дистильованої води, визначали концентрацію клітин в 1 мл отриманої
суспензії (методом підрахунку клітин в лічильній камері). Після цього суспензію
розводили стерильною дистильованою водою. Загальний об’єм нічної культури
становив 5 мл.
Розчин FeSO4 готували безпосередньо перед дослідом. Використовували наступні
концентрації солі: 0,01; 0,1; 1; 10 та 100 мМ FeSO4. Клітини в розчині солі
інкубували протягом двох годин у чашках Петрі. Нічну культуру перед дослідом
розводили з таким розрахунком, щоб в кожному дослідному і контрольному варіанті
при інкубації в чашках концентрація клітин становила приблизно 200000 кл./мл. В
кожну чашку додавали однаковий об’єм розведеної нічної культури. Розчини солі
готували в окремих пробірках. В дослідні чашки додавали однаковий об’єм розчину
солі. В контрольну чашку замість розчину солі додавали рівний об’єм
дистильованої води. Концентрація FeSO4 в суміші «розведена нічна
культура+розчин солі» відповідали приведеним вище значенням. По закінченні
інкубації, клітинні суспензії з дослідних та контрольної чашок розводили
дистильованою водою і висівали по 0,1 мл на чашки Петрі з агаризованим поживним
середовищем наступного складу: 20 г/л глюкози, 20 г/л пептону і 10 г/л
дріжджового екстракту. Ступінь виживання дріжджів оцінювали за кількістю
утворених на чашках колоній, які підраховували через 1,5–2,0 доби.
Культивування дріжджів на зброджуваних та незброджуваних джерелах вуглецю.
Посівний матеріал вирощували в 10 мл середовища YPD (2% (маса/об’єм) глюкози,
2% (маса/об’єм) пептону, 1% (маса/об’єм) дріжджового екстракту) у конічній
колбі об’ємом 100 мл протягом 18 годин, без аерації при температурі 30 °С.
Надалі, для експериментів зі зброджу-ваним джерелом вуглецю – глюкозою –
використовували середовище YPD, а для експериментів з незброджуваним джерелом –
середовище YPE, яке має такий самий склад, як і YPD, але 2% глюкози замінено на
2% (за об’ємом) етанолу. Під час експерименту клітини вирощували в 34 мл
середовища в колбах об’ємом 500 мл з барботажем повітрям при температурі 30 °С
до досягнення стаціонарної фази, на якій концентрація клітинної суспензії
становила приблизно 150·106 кл/мл. Барботаж забезпечували прокачуванням
повітрям зі швидкістю близько 0,04 м3/год. Число клітин в 1 мл культури
визначали підрахунком клітин у гемоцитометрі. Експериментальні культури
засівал
- Київ+380960830922