РОЗДІЛ 2
Матеріали та методи досліджень
2.1. Об’єкт досліджень
Об’єктами дослідженнь були позаклітинні ферменти б-N-ацетилгалактозамінідаза
(a-2-ацетамідо-2-дезокси-Д-галактозид ацетамідо-дезоксигалактогідролаза - КФ
3.2.1.49) та б-галактозидаза (б-D-галактозид галактогідролаза К.Ф. 3.2.1.22.)
Aspergillus niger Thom. (185ш).
2.2. Скринінг
Скринінг продуцентів проводився серед штамів культур мікроміцетів, дріжджів та
бактерій із Української колекції мікроорганізмів.
Мікроміцети культивували на рідкому поживному середовищі такого складу
(середовище 1), в г/л: соєве борошно – 15,0; сечовина – 0,3; (NH4)2SO4 – 1,4;
KH2PO4 – 2,0; MgSO4ґ7H2O – 0,3; CaCl2 – 0,3; дріжджовий автолізат – 0,5; рН 5.2
[195].
Для вирощування дріжджів використовували наступне поживне середовище
(середовище 2), в г/л: галактоза – 20,0; сечовина – 1,0; дріжджовий автолізат –
0,3; KH2PO4 –0,5; MgSO4ґ7H2O – 0,25; KCl – 0,3; бичача кров – 10,0; рН 5.8
[195].
Бактерії вирощували [196] на рідкому поживному середовищі (середовище 3), в
г/л: галактоза – 10,0; (NH4)2SO4 – 6,0; MgSO4ґ7H2O – 2,0; СаСО3 – 3,0;
дріжджовий автолізат – 0,5; рН 7.0-7.2.
Культивування мікроорганізмів на вказаних середовищах проводили глибинним
способом у пробірках на качалці зі швидкістю перемішування 220 об/хв, при
температурах 26-28оС (мікроміцети та дріжджі), та 36оС (бактерії) на протягом
2-4 діб. Біомасу відділяли фільтруванням, або центрифугуванням, і у
супернатанті визначали глікозидазні активністі.
2.3. Оптимізація умов культивування
Як базове нами було використано адаптоване раніше у повному факторному
експерименті мінеральне середовище, яке містило оптимальне співвідношення
катіонно-аніонних компонентів для синтезу глікозидаз (у г/л): КН2РО4 - 2,0;
МgSO4ґ7Н2О - 0,3; CaCl2 - 0,3; (NH4)2SO4 - 0,6; сечовина - 0,4; рН 5.2 [197].
Вирощування грибної культури проводили в умовах глибинного культивування у
колбах Ерленмейєра (500 мл). Як джерело вуглецю використовували: глюкозу,
галактозу, лактозу, мальтозу, ксилозу, арабінозу, рамнозу, манозу, рафінозу,
фруктозу, трегалозу, сахарозу, маніт, сорбозу, інозит, кукурудзяне та соєве
борошно (в концентрації 10 г/л).
Як джерело азоту у середовище вносили: NaNO3, NaNO2, (NH4)2SO4, (NH4)2NO3,
сечовину, сечовину + (NH4)2SO4 у співвідношенні (2:3) та пептон. Неорганічні
джерела вносили у концентрації 1,5 г N2/л, пептон – 5 г/л.
Умови культивування оптимізували на середовищі, що було адаптоване за джерелами
вуглецю та азоту. Вплив рН на біосинтез ферментів вивчали, вирощуючи культуру
продуцента при вихідних значеннях рН середовища 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0. З
метою виявлення оптимальних умов біосинтезу, культуру A.niger вирощували у
колбах з об’ємом 50, 100, 150, 200 мл поживного середовища, при обертах качалки
160, 220, 240 об/хв., температурі 25, 28 та 32оС. Посівний матеріал вносили у
концентрації 5, 10 та 20 % від об’єму середовища, що відповідає »20, 50 та 100
мг сухої речовини міцелію.
2.4. Визначення біомаси
проводили ваговим методом після її відділення від культуральної рідини,
відмивання дистильованою водою та висушування до постійної ваги при 100оС.
2.5. Дослідження індукуючих властивостей деяких речовин
а) Вивчення впливу цукрів проводили на середовищі (І), що було адаптоване за
мінеральними компонетами та джерелами вуглецю і азоту (г/л): KH2PO4 – 2,0;
MgSO4 ґ H2O – 0,3; CaCl2 – 0,3; пептон – 7,5; соєве борошно – 25,0; рН – 6,0.
Глюкозу, галактозу, лактозу, манозу, мальтозу, сахарозу, арабінозу, рафінозу,
рамнозу, ксилозу та D-галактозамін вносили у середовище росту у концентраціях:
0,1; 0,25; 0,5; 1,0; 1,5 та 2,0 % на 24 годину культивування. Паралельно тіж
вуглеводи (у концентрації 1%) вносили у точці росту у середовище, що не містило
соєвого борошна (ІІ), та як додаткове джерело вуглецю у середовище (І).
Культуру вирощували на протязі 6 діб.
б) Вивчення впливу сухої бичачої крові та деяких похідних гуанідину
Було використано наступні речовини: дифенілгуанідин, аміногуанідин карбонат,
аміногуанізон диметиламінобензальдегіду, нітроаміногуанізон саліцилового
альдегіду, нітроаміногуанізон диметиламінобензальдегіду, гуанідин карбонат та
гуанідин хлорид. Для визначення впливу цих речовин на активність препаратів
ферментів, останні додавали до реакційної суміші у концентраціях 0,1 та 0,01 %,
час експозиції — 90 хв.
Для визначення можливості використання цих речовин та сухої бичачої крові як
індукторів синтезу досліджуваних глікозидаз вивчали більш широкий спектр їх
концентрацій: гуанідини в концентраціях 0,01; 0,05; 0,1; 0,25; 0,5 %, а бичача
кров — від 0,01 до 5 %.
в)Вивчення впливу координаційних сполук германію
Були використані синтезовані комплекси германію (IV) з янтарною (Н2Suc),
оксіетилімінодіоцтовою (Н2Oeida) та імінодіянтарною (H4Ids) кислотами, а також
однорідно- та різнолігандні комплекси германію (IV) – продукти взаємодії
триамонійної солі оксіетилидендифосфонової кислоти ((NH4)3HL) та оксикислот:
винної (H4Tart), лимонної (H4Citr), тріоксиглутарової (H4Toglut), а також
діоксид германію (ІХ). Склад отриманих комплексів: [Ge(OH)2(NаSuc)2].2H2O (I);
[GeOH(Oeida).H2O].H2O (II); [Ge(OH)2(NаHIds)2] (III);
[Ge(OH)2(NH4)3HL)(H2Tart)] (IV); [Ge(OH)2(NH4)3HL)(H2Citr)] (V);
[Ge(OH)2(NH4)3HL)(H2Toglut)] (VI); [Ge(OH)2((NH4)2HL)2] (VII);
[Ge(OH)2(H2O)2(NH4)HL] (VIII). Також були використані компоненти комплексів —
діоксид германію (ІХ) та ліганди: тріоксиглутарова (Х), винна (ХІ),
оксіетилидендифосфонова (ХІІ), оксіетилімінодіоцтова кислоти (ХІІІ).
При дослідженні впливу перерахованих сполук на синтез
a-N-ацетилгалактозамінідази та a-
- Київ+380960830922