РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріали дослідження.
Об'єктом дослідження були 120 культур моноцитів та 110 культур лімфоцитів периферійної крові практично здорових донорів-чоловіків віком 20-24 років. Забір крові в обсязі 20 мл проводили з кубітальної вени в ранкові години (8.00-9.00) до їжі. Кров вносили до стерильних скляних пробірок, які містили 0,2 мл гепарину, перемішували та для отримання плазми відстоювали протягом 2 год в термостаті при 37 ? С. Отримана плазма крові в подальшому використовувалась для виділення моноцитів та лімфоцитів.
Донори, кров яких використовувалась для проведення експериментів, були ретельно обстежені з метою виключення наявності гострих та хронічних інфекційних й соматичних захворювань, стресу безпосередньо перед забором крові [44]. У всіх донорів бралась кров для визначення загальної кількості лейкоцитів та відсоткового вмісту моноцитів та лімфоцитів.
ЛПС грамнегативних бактерій отримували з культур мікроорганізмів родів Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Haemophilus, Bacteroides, Prevotella, Fusobacterium, виділених від 120 хворих на гнійно-запальні захворювання, які находились на стаціонарному лікуванні в Луганській обласній клінічній лікарні та в Краснодонському територіально-медичному об'єднанні Луганської області з 1999 р. по 2001 р. Встановлення родової приналежності культур та видову ідентифікацію проводили згідно з наказом Міністерства охорони здоров'я СРСР № 535 від 22 квітня 1985 р. "Про уніфікацію мікробіологічних (бактеріологічних) методів дослідження, які застосовуються в клініко-діагностичних лабораторіях лікувально-профілактичних установ" та "Визначника бактерій Берджі" [69].
Для ідентифікації виділених бактерій використовувалися комерційні тест-системи Мікро-Ла-Тест продукції АТ "Лахема"? (Чехія). Ідентифікацію анаеробних бактерій проводили за допомогою призначеної для цього системи API 20 A Ref. 20300 (виробництва фірми bioMerieux? (Франція)).
2.2. Методи дослідження.
Препарати ЛПС одержували з грамнегативних бактерій водно-феноловою екстракцією при 65 ? С [58, 107, 134, 135, 137]. Очищення виконували обробкою 50 нг/мл РНКазою (фірми Sigma) та 16 нг/мл ДНКазою (фірми Sigma) з наступним діалізом через 50 мМ трис-буфер та центрифугуванням при 20 000 g протягом 30 хв. Осадок сушили ліофільно. Для відновлення активності ЛПС та їх структурних частин застосовували редокс-обробку. Розчини ЛПС оброблювали 2-меркаптоетанолом з остаточною концентрацією 0,1 М протягом 18 год при 4 ? С. Розчин зберігався при -20 ? С. Перед використанням розчин піддавали дії ультразвуку у водяній лазні протягом 5 хв. Використовували наступні робочі концентрації ЛПС (мкг/мл): 10,0; 50,0; 100,0.
Виділення моноцитів з периферичної крові донорів здійснювали за методикою Boyum [66] в градієнті щільності фікол-верографін. З 76 % верографіну готували 14,3 % робочий розчин: до 20 мл ампульного верографіну добавляли 86,2 мл бідистильованої води і 0,1 мл 0,1 н розчину NaOH. Щільність виготовленого розчину (1,077 г/мл) перевіряли ареометром. Нашаровували 4 мл гепаринізованої венозної крові, розведеної 1:1 забуференим фосфатним буфером ізотонічним розчином натрію хлорид, при рН=7,2, на поверхню розчину верографіну (4 мл) і негайно центрифугували при 1500 об/хв протягом 40 хв. Вміст пробірки розділявся на 4 прошарки (зверху вниз): плазма, кільце мононуклеарних клітин, верографін, еритроцитарна маса. Кільце мононуклеарів і верхній прошарок верографіну відсмоктували пастерівською піпеткою. Мононуклеари тричі відмивали від верографіну при 1000 об/хв по 10 хв. Якщо спостерігалася домішка еритроцитів, їх руйнували 0,83 % розчином амонію хлорид на трис-буфері, рН=7,65. Моноцити відокремлювали від лімфоцитів в полістиролових чашках Петрі шляхом використання спроможності моноцитів прилипати до дна чашки при інкубації з повітрям, яке містило 5 % СО2 при 37 ? С протягом 1 год. Неприлиплі клітини видаляли аспірацією. В чашки Петрі з моноцитами, які залишились, вносили розчин Версену в середовищі 199, витримували протягом 30 хв при 37 ? С, після чого клітинну визвесь тричі відмивали від середовища Версену при 1000 об/хв по 10 хв. Моноцити ідентифікували шляхом фарбування за Романовським-Гімзою. Відсоток моноцитів складав 94, життєздатність складала 98 %. З отриманої визвесі моноцитів готували робочу концентрацію 106 клітин/мл.
Виділення лімфоцитів з периферичної крові здійснювали в градієнті щільності фікол-верографін. З 76 % верографіну готували 14,3 % робочий розчин: до 20 мл ампульного верографіну добавляли 86,2 мл бідистильованої води і 0,1 мл 0,1 н розчину NaOH. Щільність виготовленого розчину (1,077 г/мл) перевіряли ареометром. Нашаровували 4 мл гепаринізованої венозної крові, розведеної 1:1 забуференим фосфатним буфером ізотонічним розчином натрію хлорид, при рН=7,2, на поверхню розчину верографіну (4 мл) і негайно центрифугували при 1500 об/хв протягом 40 хв. Вміст пробірки розділявся на 4 прошарки (зверху вниз): плазма, кільце мононуклеарних клітин, верографін, еритроцитарна маса. Кільце лімфоцитів і верхній прошарок верографіну відсмоктували пастерівською піпеткою. Лімфоцити тричі відмивали від верографіну при 1000 об/хв по 10 хв. Якщо спостерігалася домішка еритроцитів, їх руйнували 0,83 % розчином амонію хлорид на трис-буфері, рН=7,65.
Для підготовки суспензії лімфоцитів у концентрації 2*109 /л проводили розрахунок за формулою:
В = (а/40-1)*с, (2.1)
де а - кількість лімфоцитів у камері Горяєва,
с - кількість суспензії лімфоцитів, залишених у пробірці;
В - кількість фосфатно-буферного розчину, яку необхідно додати.
Використання описаного методу дозволяє виділяти з крові біля 90 % лімфоцитів. Суправітальне забарвлення виділених лімфоцитів трипановим синім свідчило про життєздатність 98-99 % клітин.
Визначення фагоцитарної активності моноцитів