Транспорт Са2+ в мітохондріях гладеньком`язових клітин

розділ 2) і обробяли розчином дигітоніну. Така обробка гладеньком`язових
клітин даним детергентом не пов`язана з використанням травмуючих препаративних
процедур, як це можна спостерігати у випадку отримання фракції ізольованих
субклітинних структур. Ми використовували дигітонін у малих концентраціях (0,1
мг/мл), при цьому деструктивний ефект проявляється на рівні саме плазматичної
мембрани, що забезпечує доступ різних реагентів (субстратів, інгібіторів,
активаторів, іонофорів) до внутрішньоклітинних Са2+-пулів; при цьому
функціональна (стосовно транспорту Са2+) активність внутрішньоклітинних
мембранних структур (мітохондрії, ендоплазматичний ретикулум) зберігається [3,
5].
У наших дослідженнях, використовуючи вищезгадану експериментальну модель, ми
поставили за мету біохімічно ідентифікувати Mg2+,АТР-залежний транспорт Са2+ у
мітохондріях клітин міометрія та вивчити його кінетичні властивості,
застосовуючи ізотопну методику (45Са2+). Відповідні експериментальні результати
узагальнені в табл. 2 (розд. 3, 4).
Перш за все, нами була досліджена кінетика Mg2+,АТР-залежного накопичення іонів
Са із стандартного середовища інкубації у мітохондріях гладеньком`язових клітин
міометрія. На 4-5-ій хвилинах спостерігався стаціонарний рівень акумуляції Са2+
- 1460+54 пмоль Са2+/106 міоцитів. Початкова швидкість акумуляції Са2+ Vo
становила 1260+130 пмоль Са2+/106 клітин за 1 хв. Система транспорту Са2+, яку
ми вивчали, була абсолютно залежна від іонів Mg.
Далі ми досліджували властивості Mg2+,АТР-залежної акумуляції іонів Са у
мітохондріях міоцитів матки, а саме: субстратну та катіонну специфічність,
чутливість до дії двовалентних іонів (Ni2+, Co2+, Cu2+), спорідненість до
реагентів – АТР, Mg2+, Са2+, чутливість до дії різних ефекторів
мембранозв`язаних Са2+-помп та іонів (H+, K+, Na+).
ТАБЛИЦЯ 2.
ВЛАСТИВОСТІ СИСТЕМИ Mg2+,ATP-ЗАЛЕЖНОГО ТРАНСПОРТУ ІОНІВ Са МІТОХОНДРІЙ
ГЛАДЕНЬКОГО М`ЯЗУ (M+ m; n = 5 - 8)
Параметр чи
характеристика
Значення
Наявність стаціонарності
акумуляції Са2+
наявна
Стаціонарна акумуляція Са2+,
пмоль Са2+/106 клітин на 5 хв.
1460+54
Початкова швидкість
акумуляції Са2+
Vo, пмоль Са2+/106 клітин за 1 хв.
1260+130
Потреба у іонах Mg
абсолютно необхідний
Катіонна специфічність
Mg2+>>Co2+, Ni2+,Cu2+
Чутливість до блокуючої дії іонів
металів (I0,5, мкМ; nH):
Cu2+ I0,5
nH
Ni2+ I0,5
nH
Co2+ I0,5
nH
Cu2+>Ni2+>Co2+
4,2+0,2
1,3+0,1
51+4
0,8+0,1
290+30
1,1+0,1
Субстратна специфічність (за наявності Mg2+ у середовищі)
АТР>>GTP>CTP>UTP
Характеристики Mg2+-залежності
[Mg2+]опт, мМ
10
КMg2+, мМ
4,27+0,04
nH по Mg2+
0,9+0,1
Vmax, пмоль Са2+/106 клітин за 10 хв
3850+60
Характеристики ATP-залежності
[АТР]опт, мМ
1 - 3
Кm, мМ
0,10+0,01
nH по АТР
1,0+0,1
Vmax, пмоль Са2+/106 клітин за 10 хв
1321+65
Участь компонентів середовища інкубації у забезпеченні
транспорту іонів Са
Потреба у субстраті окиснення за присутності АТР (3 мМ):
Кm, мМ
Vmax, пмоль Са2+/106 клітин за 10 хв
Відносна
0,30+0,05
1420+60
Потреба у фосфаті за присутності АТР (3 мМ):
Vmax, пмоль Са2+/106 клітин за 10 хв
Відносна
2028+85
Характеристики Са2+-залежності
[Са2+]опт, мкМ
КСа2+, мкМ
1,0+0,1
nН по Са2+
0,9+0,1
Vmax, пмоль Са2+/106 клітин за 2 хв
2745+130
Відомо, що дефіцит або надмірний вміст в тканині іонів ряду двовалентних
металів призводить до порушення скоротливої функції матки [36, 168]. Між тим
дуже мало даних відносно впливу двовалентних катіонів на Са2+ - уніпортер
мітохондрій гладеньком`язових клітин. Ми дослідили, що Me2+, що були
використані у дослідах, не здатні заміняти Mg2+ в процесі активного
АТР-залежного транспорту Са2+ в мітохондріях міоцитів матки. Катіонна
специфічність задовільняє слідуючій послідовності: Mg2+ >> Co2+, Ni2+, Cu2+.
Катіони досліджених двовалентних металів в концентрації 3 мМ з різним ступенем
ефективності гальмували Mg2+,АТР-залежне накопичення Са2+ у мітохондріях
гладеньком`язових клітин матки, причому максимальну пригнічувальну дію на Са2+
- уніпортер мали іони Cu (I0,5 = 4,2+0,2 мкМ). У відповідності із значеннями
І0,5, неспецифічний галь-мівний ефект катіонів двовалентних металів на
Mg2+,ATP-залежне нако-пичення Ca2+ в суспензії міоцитів матки відповідає
послідовності: Сu2+ > Ni2+ > Со2+. Судячи із значень коефіцієнта Хілла nH, у
своїй гальмуючій дії іони Cu демонструють слабу позитивну кооперативність, а
іони Ni – слабу негативну кооперативність (значення nH ставить 1,3 та 0,8
відповідно). Гальмуючий ефект іонів Со майже некооперативний (nH = 1,1) (табл.
2).
Для системи транспорту Са2+ у мітохондріях міоцитів матки характерна абсолютна
субстратна специфічність відносно АТР, так як саме цей нуклеозидтрифосфат, а не
GTP, CTP чи UTP, забезпечував нечутливу до тапсигаргіну акумуляцію кальцію в
міоцитах. Субстратна специфічність відповідає послідовності АТР (100%) >> GTP
(10%) > CTP (1-2%) > UTP (1%) (за 100% приймають накопичення іонів Са у
присутності АТР).
Активність Mg2+,АТР-залежної Са2+-акумулюючої системи мітохондрій зростає по
мірі збільшення концентрації іонів Mg, досягаючи максимального значення, що
спостерігається при концентрації Mg2+ 10 мМ. Уявна константа активації по Mg2+
КMg2+ дорівнювала 4,27+0,04 мМ, і, відповідно, була фізіологічно значимою, бо
відповідала мілімолярним значенням концентрації іонів Mg. Величина коефіцієнта
Хілла nH по Mg2+ становить 0,9+0,1. Отже активуюча дія іонів Mg на накопичення
Са2+ у мітохондріях є практично некооперативним процесом. Значення Vmax по Mg2+
становить 3,85+0,06 нмоль Са2+/106 клітин за 10 хв.