РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали та реактиви, які було використано в роботі
При виконанні роботи були використані наступні реактиви:
- поліетиленгліколь 6000, уранілацетат, кумассі блакитний R-250, 1,2 - фенілендиаміндигідрохлорид, N-n-нітрофенілфосфат, тритон X-100 ("Serva", Німеччина);
- додецилсульфат натрію, 4-хлор-1-нафтол ("Merck", Німеччина);
- набір маркерних білків LMW ("Pharmacia", Швеція);
- повний ад'ювант Фрейнда, неповний ад'ювант Фрейнда ("Sigma", США);
- нітроцелюлозна мемебрана ("Schleicher and Schuell", Німеччина);
- гліцин, акриламід, біс-акриламід, понсо ("BDH", Англія);
- неорганічні компоненти буферних систем вітчизняного виробництва марок "хч" та "чда";
- 96-лункові планшети ("Labsystems", Фінляндія);
- антитіла проти імуноглобулінів кроля, кон'юговані з лужною фосфатазою;
- антитіла проти імуноглобулінів кроля, кон'юговані з пероксидазою хрону ("Bio-Rad", США).
2.2. Відбір зразків
Метод виявлення та відбору рослинного матеріалу за зовнішніми симптомами ураження є одним з найпростіших та найпоширеніших методів. Даний метод базується на здатності багатьох вірусів викликати на рослинах характерні симптоми ураження, які проявляються у вигляді мозаїки, хлорозів, штрихуватості листкових пластинок, їх деформації, некрозів, вкорочення стебел та пагонів, деформації квітів та утворення квіткових химер.
Для дослідження біологічних характеристик вірусів та їх різноманіття відбирали зразки дикорослих орхідей природної флори України і культурних орхідей закритого грунту в трьох повторностях та вносили в стерильні пакети.
Для препаративного виділення та накопичення вірусів відбирали зразки культурних орхідей та рослин-індикаторів з візуальними симптомами вірусного ураження. Дослідження проводили в двох основних регіонах існування дикорослих орхідей: Кримський півострів та зона Карпат. Декоративні орхідеї відбирали в колекціях закритого грунту ботанічних садів України: Національний ботанічний сад ім. М.М. Гришка (Київ), ботанічний сад ім. О.В. Фоміна КНУ (Київ), ботанічний сад ХДУ ім. В.Н Каразіна (Харків), ботанічний сад ДДУ (Дніпропетровськ), ботанічний сад КДУ (Кривий Ріг) та Нікитський ботанічний сад (Ялта).
2.3. Виділення та очищення вірусних препаратів
Виділення та очищення вірусів проводили за двома методиками [79, 96], що дало змогу порівняти концентрацію вірусу, отриманого в результаті очистки. Як вірусвмісний матеріал використовували листя рослини Cymbidium hуbridum з чітко вираженими симтомами мозаїчності та некротизації.
Варіант1
1. Попередньо заморожене листя Cymbidium з симптомами вірусної інфекції гомогенізували на міксері з додаванням 0,5 М натрій-цитратного буферу pН 6,4 у співвідношенні 1:2 .
2. Рослинний сік віджимали крізь капроновий фільтр та центрифугували при 3000 об/хв протягом 20 хв.
3. Надосадову рідину (НОР) перемішували на холоду з додаванням :
* тритону Х-100 до кінцевої концентрації 0,2 % ;
* ?-меркаптоетанолу до кінцевої концентрації 0,1% ;
* бутанолу до кінцевої концентрації 8,5 % по краплинам ;
* ЕДТА до кінцевої концентрації 0,002 М.
Інкубували протягом ночі при 4?С.
5. Після інкубації вірусвмісну рідину центрифугували (5000 об/хв 25 хв).
6. Отриману НОР перемішували за допомогою магнітної мішалки на холоду протягом 60 хв, з додаванням :
* ПЕГ-6000 з розрахунку 4г на 100мл ;
* NaCl в розрахунку 0,25 г на 100 мл ;
7. Вірусвмісний матеріал центрифугували (20хв 8000 об/хв). Осад ресуспендували 0,1 М трис-боратним буфером pН 8,5 з додаванням 0,001 М ЕДТА і азиду натрію (NaN3) з розрахунку 0,1 мл буферу на кожні 10 мл освітленого екстракту. Витримували при 4?C протягом ночі.
8. Вірусвмісну рідіну центрифугували 30 хв. при 5000 об/хв .
9. НОР центрифугували на центрифузі Backman LK-50B (ротор SW-40) при 22000 об/хв протягом 120 хв.
10. Осад ресуспендували у 0,1 М трис-боратному буфері pН 8,5 з 0,001М ЕДТА та азидом натрію. Витримували при 4 C? протягом ночі.
11. Вірусвмісний матеріал центрифугували при 3000 об/хв протягом 15 хв.
Варіант 2
1. Листя Cymbidium з симптомами вірусної інфекції, гомогенізували за допомогою гомогенізатора в 0,5 М натрій-цитратному буфері pH 6,5, що містив 0,002 М ЕДТА, 0,1% 2-меркаптоетанол та хлороформ в співвідношенні 1:1:1 (m:v:v).
2. Рослинний сік віджимали крізь капроновий фільтр та центрифугували при 2000 об/хв протягом 15 хв.
3. НОР центрифугували (5 000 об/хв 25хв).
4. До НОР додавали ПЕГ- 6000 (4г на 100 мл) та NaCl (0,25 на 100 мл). Перемішували на магнітній мішалці протягом 1 години при 4? C?.
5. Вірусвмісну рідіну центрифугували (5500 об/хв 25 хв). Осад ресуспендували в 1,0 мл 0,1М натрій-боратного буферу pH 8,5 на кожні 10 мл освітленого екстракту. Витримували при 4 ?C? протягом ночі.
6. Вірусвмісну рідину цетрифугували ( 6000 об/хв 15 хв).
7. НОР ценрифугуванли (22 000 об/хв 2 год) на центрифузі Backman LK-50B (ротор SW-40). Осад ресуспендували в 0,1 М натрій-боратному буфері pH 8,5.
8. Супернатант освітлювали центрифугуванням (6000 об/хв 15 хв).
При дослідженні вірусвмісних препаратів концентрацію вірусу визначали спектрофотометрично за формулою [39]:
C = A260*N/Ke
де С-концентрація вірусу в мг/мл,
A260- екстинкція при довжині хвилі 260 нм,
N- розведення вірусного препарату,
Ke - коефіцієнт екстинкції, що для ВМЦ становить- 2,7, а для ВКПО-2,8 [6, 79].
2.4. Вивчення біологічних характеристик вірусів орхідей
Біологічні властивості вірусів орхідей закритого грунту вивчали за допомогою спектру рослин-індикаторів, загальноприйнятих для ВМЦ, ВКПО та інших орїхідних вірусів [17, 79, 204]. Для ВМЦ це - Chenopodium amaranticolor Coste et Reyn., Datura stramonium L. (зони некрозу, що повільно розвиваються, локальна реакція); N. tabacum cv. Samsun ( невеличкі за розміром зони некрозу; локальна реакція), а для ВКПО - Nicotiana tabacum cv. Xanthi -nc (зони локальних некрозів на старому листі; зони локальних кільцевих некрозів - на молодому), Chenopodium amaranticolor