РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Згідно задачам дослідження були вивчені сечоводи 130 ембріонів та плодів людини у віці від 5-6 тижнів до 9 місяців пренатального розвитку. Розподіл матеріалу за віком відображений у таблиці 2.1.
Матеріал для досліджень був отриманий з акушерських та гінекологічних відділень клінічних лікарень м. Києва після спонтанних абортів, передчасних пологів, які виникли внаслідок причин, не пов'язаних із захворюваннями органів сечостатевого апарату та серцево-судинної системи: психічної або механічної травми, після штучного переривання вагітності. Ембріональний та плідний матеріал був отриманий від практично здорових жінок, у яких перебіг вагітності був нормальним.
Пренатальний період онтогенезу людини за загальноприйнятою схемою [134,204,45] поділяється на два періоди: ембріональний (до кінця 8-го тижня внутрішньоутробного розвитку) і плодний. Вік ембріону визначався за результатами гінекологічного обстеження, розмірами тім'яно-куприкової довжини у мм, та за довжиною стопи у мм [207], а також згідно таблиць, запропонованих Б.Ю.Абрамовим [1]. Вік плодів визначали також шляхом вимірювання тім'яно-куприкового та тім'яно-п'яткового розмірів за таблицями Л.І.Фаліна [134].
На світлооптичному рівні розвиток сечоводу людини на протязі 5-16 тижнів пренатального періоду вивчався на тотальних серійних зрізах із колекції кафедри нормальної та топографічної анатомії Буковинської державної медичної академії (м. Чернівці).
Для вивчення гістологічної будови сечоводу матеріал фіксували у розчині Ліллі, проводили через батарею спиртів висхідної концентрації, через суміш спирт-хлороформ, хлороформ, хлороформ-парафін, парафін і заливали у парафін, за загальноприйнятою методикою [72].
Гемомікроциркуляторне русло сечоводу плодів людини вивчали за допомогою комплексу ін'єкційних методів із послідуючим забарвленням гістологічних зрізів гематоксілін-еозином та пікрофуксіном по ван Гізону.
Для вивчення особливостей становлення форми ендотеліоцитів і контурів ендотеліальних меж усіх ланок гемомікроциркуляторного русла сечоводу використовували метод імпрегнації, шляхом ін'єкції 0,1-0,25% розчину нітрату срібла через висхідну аорту за L.Ranvier [235] в модифікації О.А.Сушко і Л.В.Чернишенко [130]. Сечовід, а також його окремі оболонки занурювали в дистильовану воду й опромінювали кварцовою лампою до тих пір, поки судини не набували світло-коричневого кольору. Потім препарати розміщували в скельцях, фіксували в розчині Ліллі, проводили через батарею спиртів висхідної концентрації. Просвітляли в ксилолі і заливали бальзамом.
Ангіоархітектоніку гемомікроциркуляторного русла сечоводу плодів людини вивчали за допомогою ін'єкції судин 30-35% водною зависсю чорної туші, а також 0,1 - 0,25 % розчином нітрату срібла через висхідну аорту. Після судинної ін'єкції сечовід, а також його окремі оболонки фіксували в розчині Ліллі, проводили через батарею спиртів висхідної концентрації, просвітляли в ксилолі і заключали в бальзам. Отримані тотальні препарати вивчали й фотографували за допомогою бінокулярної лупи МБІ-2 та світлооптичних мікроскопів МБІ-6 і "Opton Axiophot".
З метою кількісного вивчення ланок гемомікроциркуляторного русла сечоводу на препаратах імпрегнованих по методу Ранв'є був застосований окуляр-мікрометр МОВ-1-15 на мікроскопі МБІ-6 (вимірювали довжину й ширину ендотеліальних клітин в 15 полях зору у кожного об'єкта).
Для вивчення ультраструктурних особливостей розвитку та морфології оболонок сечоводу людини і ланкоспецифічних відділів його гемомікроциркуляторного русла був використаний метод трансмісійної електронної мікроскопії.
Матеріал для ультраструктурного дослідження був отриманий не пізніше 2 годин після смерті плода і безпосередньо після штучного переривання вагітності. Згідно даних Ю.М.Лопухіна і співавт.[75] ультраструктурні ознаки постмортального аутолізу з'являються наприкінці другої години після смерті організму.
Шматочки сечоводу розміром 0,5-1 мм фіксували у 2,5 % розчині глютар-альдегіду, який був приготовлений на 0,1 М фосфатному буфері (рН=7,4) на протязі 1,5-2 годин при кімнатній температури. Потім постфіксували у 1% розчині чотирьохокису осмія на протязі 1 години. Після фіксації блоки промивали в 3-4 порціях 0,1 М фосфатного буфера (рН=7,4) по 10-15 хвилин у кожній порції. Препарати проводили через батарею спиртів висхідної концентрації (50%, 70%, 96%, 100%) по 15 хвилин у кожній порції. Після цього препарати проводили через суміш спирт-ацетон, ацетон. З ацетону препарати послідовно проводили через суміш епону й ацетону у співвідношенні 1:3; 1:1; 3:1. В кожній суміші епону й ацетону препарати тримали по 2 години і потім вміщували остаточно в заливне середовище (суміш аралдиту М з епоновими смолами). Полімерізацію блоків проводили поступово в термостатах при температурі 36°С, 45°С, 60°С. При кожній температурі блоки витримували на протязі доби. Напівтонкі зрізи, товщиною 0,5-2 мкм фарбували розчином метиленового синього, вивчали на мікроскопі МБІ-4, фотографували в мікроскопі "Opton Axiophot". Після цього, орієнтуючись на напівтонкі зрізи, прицільно заточували блоки для одержання ультратонких зрізів. В деяких випадках робили серії напівтонких зрізів. Напівтонкі зрізи готувались на ультратомі "ULTRACUT". Ультратонкі зрізи, отримані з блоків, готувались за допомогою скляних ножів на ультрамікротомі LKB-8800 і ЦМТП-4.
Ультратонкі зрізи сріблястого кольору контрастували уранілацетатом за М.L. Watson [270] і цитратом свинцю за Е.S. Reynolds [236]. Препарати вивчали й фотографували на електронних мікроскопах УЕМВ-100БР, Philips EM 400T.
Таблиця 2.1 Віковий розподіл досліджуваного матеріалу
Вік ембріонів та плодів людиниВсього досліджено за даним вікомІн'єкція судин водною суспензією чорної тушіІмпрегнація судин розчином нітрату сріблаГістологічні методиМетод трансмісійної електронної мікроскопії5-6 тижнів6--336-7 тижнів7--347-8 тижнів8-
- Київ+380960830922