РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
2.1. Реагенти та матеріали
У роботі було використано такі матеріали та реактиви: трис(гідроксиметил)амінометан, хромогений субстрат плазміну S2251 (H-D-Вал-Лей-Ліз-pNa), ?-казеїн, диізопропілфторфосфат (DFP, ДФФ) ("Merck", Німеччина), п-нітрофеніловий ефір гуанідинбензойної кислоти (p-NFGB) ("Sigma", США); стрептокіназу Kabikinase ("Pharmacia AG", Швеція), Cibacron Blue-Sepharose, Sepharose CL 4B, Sephacryl S-200, Superose 12 HR, протеїн А-Sepharose ("Pharmacia", Швеція; "Amersham Pharmacia Biotech", США), альбумін сироватки бика ("Calbiоchem", США). Неорганічні сполуки ступеню чистоти 'хч' або вищої відчизняного виробництва. Планшети для ІФА ("Costar", США; "Nunc", Nalge Nunc International, США).
2.2. Методи досліджень
2.2.1. Одержання плазміногену
Для одержання препаратів плазміногену було використано загально вживаний останнім часом метод афінної хроматографії на лізин-сефарозі. До незаперечних переваг цього методу належать швидкість і зручність роботи, висока повторюваність результатів і забезпечення необхідної чистоти та нативності білка. Також дуже важливим є практичне унеможливлення активації проферменту в момент, коли він зв'язаний на носії, що дає змогу одержувати препарати плазміногену позбавлені чи з дуже низькою спонтанною активністю.
Глу-плазміноген одержували з донорської плазми на лізин - сефарозі [189]. Плазму, попередньо розведену вдвічі 50 мМ натрій фосфатним буфером, рН 7,4, з вмістом контрикалу з розрахунку 10000 од. на 1 л плазми, фільтрували та наносили на колонку з лізин-сефарозою, попередньо врівноважену тим же буфером без контрикалу. Колонку відмивали 50 мМ натрій фосфатним буфером, рН 7,4, з вмістом 0,2 М NaCl. Елюцію проводили 0,15 М 6-АГК у тому ж буфері. Одержаний препарат плазміногену висолювали сульфатом амонію з розрахунку 41 мг солі на 1 мл елюату. Потому проводили гель-фільтрацію на сефакрил S-200 та зберігали одержаний препарат при -20 оС.
Ліз-форму плазміногену одержували з фракції ІІ+ІІІ за Коном також на лізин - сефарозі [189]. Одержаний препарат плазміногену людини мав потенційну протеолітичну активність 18-22 казеїнолітичні одиниці на 1 мг білка [190]. В разі інкубації протягом 6 годин з хромогенним субстратом S2251 спонтанної активності у препараті не виявлялено. Чистоту одержаних препаратів контролювали електрофоретично у 10% ПААГ з ДС-Na [191], та в 11,5 % ПААГ з оцтовою кислотою та сечовиною за рН 3,2, (Рис. 2.2.1). [192].
2.2.2. Одержання препаратів плазміну.
Для активації плазміногену до плазміну було обрано метод з використанням імобілізованої урокінази. Використання імобілізованого активатора, завдяки його багаторазовості, значно спрощує та здешевлює методику. Окрім того, за такого підходу не потрібна додаткова очистка одержаного препарату плазміну від домішок активатора чи активаційних комплексів.
Плазмін одержували з препаратів Глу-плазміногену за стандартною методикою [193] з використанням імобілізованої на BrCN-сефарозі-4В урокінази. Плазміноген інкубували з імобілізованою урокіназою протягом 1 години при температурі 37оС у 0,05 М трис-НCl буфері, рН 7,4 з вмістом 0,15 М NaCl, 25% гліцерину. Чистоту препарату контролювали електрофоретично (Рис. 2.2.1), зберігали препарат плазміну в гліцерині розведеному до концентрації від 25% до 50% при температурі -18оС.
2.2.3. Вимірювання амідолітичної активності плазміну.
Амідолітичну активність плазміну вимірювали за допомогою хромогенного субстрату S2251 (H-D-Вал-Лей-Ліз-pNa) [194]. Це дало змогу значно скоротити об'єми інкубаційного середовища, знизивши тим самим витрати білкових препаратів і реактивів. Водночас, використання спектрофотометричного вимірювання поглинання вивільненого п-нітроаніліну дало змогу стандартизувати методику та підвищити повторюваність і достовірність результатів.
В інкубаційне середовище послідовно вносили 0,05 М трис-НСІ буфер, рН 7,4, з вмістом 0,15 М NaCl, 0,1 мкМ плазміногену, 0,3 мМ S2251, 10 IU/мл стрептокінази. Об'єм буферу розраховували таким чином, аби кінцевий об'єм проби становив 250 мкл. До контрольної проби замість стрептокінази додавали відповідний об'єм буферу. Інкубацію проводили протягом 30-60 хвилин при 37оС. Реєстрацію поглинання вивільненого п-нітроаніліну проводили в двохвильовому режимі за довжини хвилі 405 та 492 нм на ридері-спектрофотометрі для мікропланшетів Titertek Multiskan МС.
2.2.4. Вплив ?2-антиплазміну на реакцію індукції каталітичної активності Глу-плазміногену моноклональним антитілом IV-Ic.
Для дослідження впливу ?2-антиплазміну на реакцію індукції каталітичної активності Глу-плазміногену моноклональним антитілом IV-1c було обрано стандартну методику вивчення інгібування титруванням інгібітором активаційного комплексу. З метою кращої стабілізації комплексу було обрано фізіологічну фосфатну буферну систему.
У реакційне середовище, вносили послідовно без попередньої інкубації: Глу-плазміноген до кінцевої концентрації 100 нМ, ?2-антиплазмін до кінцевої концентрації 30 нМ (7,5 пмоль), антиплазміногенове моноклональне антитіло IV-1c кінцевою концентрацією 100 нМ (25 пмоль), 0,1М натрій фосфатний буфер рН 7,4, 0,3 мМ субстрату S2251. Реагенти змішували при кімнатній температурі, інкубували протягом 8 годин при 37оС. По завершенні реакції поглинання вивільненого п-нітроаніліну вимірювали як сказано вище.
2.2.5. Вплив іонної сили та іонного складу середовища на реакцію індукції каталітичної активності Глу-плазміногену антиплазміногеновим моноклональним антитілом IV-1c.
Вплив іонної сили, аніонів і катіонів середовища на реакцію індукції каталітичної активності Глу-плазміногену антиплазміногеновим моноклональним антитілом IV-1c досліджували додаючи різні солі до стандартного інкубаційного середовища реакції індукції. Характер впливу оцінювали за змінами швидкості індукції каталітичної активності плазміногену антитілом IV-1c.
Реакцію індукції проводили як описано вище. Реакція індукції каталітич