РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об'єкт дослідження, матеріали та обладнання
Об'єкт дослідження.
Зразки зрілої (38-42 тижні вагітності) плаценти були зібрані одразу після пологів або кесаревого розтину. Зразки тканини (~ 50 грам) були вирізані з центральної частини плаценти крізь усі її шари, сполучну тканину було відділено, зразок швидко промивали у холодному фізіологічному розчині для видалення крові, промокали фільтровальним папером та заморожували у рідкому азоті. Зразки зберігали у рідкому азоті до визначення ферментативної активності і при -70?С до проведення інших досліджень. Для дослідження брали лише дитячу частину плаценти.
Персональні анкети містили детальні дані про вік породіль, місце та тривалість їх проживання, рід діяльності, звички (у тому числі куріння, вживання алкоголю або наркотиків), прийом лікарських препаратів рослиного або синтетичного походження, стиль життя (проведення часу на свіжому повітрі, у транспорті, за приготуванням їжи і т. ін.), особливості харчування, тип опалення вдома.
Клінічні дані про стан здоров'я та анамнез матері, перебіг вагітності та пологів, стан здоров'я новонародженого та його параметри, перебіг попередніх вагітностей та пологів, спонтанні або медичні аборти були отримані із медичних карток породіль та новонароджених. Зразки були зібрані за узгодженням із породіллями у міських пологових будинках №3 та №4 м. Києва, Науково-дослідному інституті педіатрії, акушерства та гінекології АМН України у м. Києві, на базі міського пологового будинку №5 у м. Запоріжжі при кафедрі акушерства та гінекології Запорізького медичного університету, у міському пологовому будинку у м. Полтава та у пологовому будинку обласної кліничної лікарні №1 у м. Гомелі. Зразки плаценти із Верхньої Сілезії, м. Краків та Бещад були люб'язно надані д-ром Люциною Заморською (Польща).
Досліджувані показники. Як основні показники функціонального стану детоксикаційної системи в плаценті нами було обрано глутатіонтрансферазну активність плацентарного цитозолю та етоксикумарин 0-діетилазну активність мікросомальної фракції плаценти. Як допоміжні показники стану детоксикаційної системи нами було використано вміст відновлених низькомолекулярних тіолів, глутатіонредуктазну активність цитозолю та вміст сполук, що реагують з тіобарбітуровою кислотою. Перелічені показники є одночасно показниками окисно-відновного стану тканини. Вміст ПАВ -аддуктів в ДНК із плаценти використовували як біомаркер впливу ксенобіотиків.
Для вивчення індивідуальних особливостей детоксикаційної системи було проведено генотипування CYP1A1 462Ile/Val, GSTP1 104Ile/Val та GSTM1 +/null у досліджених зразках.
Оцінку експресії ферментів детоксикації в культивованих плацентарних клітинах проводили за допомогою Вестерн-блот та Нозерн-блот аналізу.
Використані реактиви. В роботі було використано такі реактиви:
- ферменти: протеїназа К (Serva, Німеччина та Merck, Швейцарія), РНКаза А, лізоцим (Sigma-Aldrich, США), ДНК-полімераза TAQ-pol (Perkin Elmer, США), рестриктази NcoI; Alw261 (Bsm A1) (Fermentas, Литва), EcoRI та BglII (TaKaRa, Японія), лужна фосфатаза (Boehringer Mannheim GmbH (Roche), Німеччина), Т4-ДНК лігаза (Gibco BRL Life Technologies, США) та відповідні буфери;
- субстрати та інші реактиви: 1хлор-2,4-динітробензол (ХДНБ) (Serva, Німеччина), глутатіон відновлений (GSH) (Fluka, Швейцарія та Sigma-Aldrich, США), глутатіон окислений (GSSG) (Reanal, Угорщина), NАDPН2 (Boehringer Mannheim GmbH (Roche) та Serva, Німеччина), 5,5-дитіобіс-2-нітробензойна кислота (ДТНБ) (Serva, Німеччина), дитіотреітол (ДТТ) (Reonal, Угорщина), сефадекс G-25 (Pharmacia, Швеція), трітон Х100 (Sigma-Aldrich, США), 7-гідроксикумарин (Aldrich Со, США).
Для генотипування було використано: dАТP, dТТP, dCТP, dGТP (Pharmacia Biotechnology Products, Велика Британія), 10? ПЛР - буфер, MgCl2, агароза (Chemapol, Чехословаччина), агароза високої роздільної здатності (NuSieve:Sea Kem agarose, FMC Bio Products, США), сахароза (ХЧ, Реахім, Україна), етидіум бромід, бромфеноловий синій (Sigma-Aldrich, США), гліцерол (Serva, Німеччина), стерильне мінеральне масло (аптекарське, Україна), ДНК маркери - драбина ДНК з інтервалом в 100 п. н. Gene ruller (Fermentas, Литва) та фрагменти ДНК OХ174, піддані рестрикції Hae III (Farmacea, Швеція). Праймери для генотипування GSTM1, GSTP1 та CYP1A1 були люб'язно подаровані д-ром Доротою Буткевич (Польща).
Клітини хоріокарциноми людини лінії BeWo були отримані з American Tissue Culture Collection (ATCC), США.
Для роботи із культурою тканин було використано: поживне середовище Ham's F12, ембріональна теляча сироватка (FCS), 1? PBS буфер (Phosphate- Buffered Saline) та трипсин (PAA Laboratories GmbH, Німеччина), L-глутамін, антибіотики пеніцилін, стрептоміцин та ципробан (Serva, Німеччина), 99,5% розчин диметилсульфоксиду (Sigma-Aldrich, США). Для стимуляції клітин використовували бензо(а)пірен (Sigma-Aldrich, США).
Для визначення вмісту ПАВ-ДНК аддуктів використовували: флуоресцентний барвник SYBR Green I (Molecular Probes Inc, США), азид натрію та Tween20 (Sigma-Aldrich, США), біотинильований імуноглобулін G, специфічний проти імуноглобулінів кроля, казеїн, лужну фосфатазу, люмінісцентний субстрат CDP Star з Emerald II (Tropix, США).
Для клонування ДНК було використано: набір реактивів "ТОРО ТА Сloning(r)" (Invitrogen, США), поживне середовище LB (Gibco BRL Life Technologies, США), агар (Oxoid LTD, Велика Британія), диметилформамід (Sigma-Aldrich, США), X-gal (Сarl Roth GmbH, Німеччина), ампіцилін (Serva, Німеччина), набір реактивів для елюції ДНК з агарозного гелю "QIAEXII Agarose Gel Extraction Kit" (Quiagen Inc, США), маркер концентрації ДНК ?/HindIII (Stratagene, США), набір реактивів для препаративного виділення плазмідної ДНК "Jet Star Plasmid Maxi Kit" (Genomed, Німеччина).
Для Вестерн - блот аналізу було використано: акриламід 30% "Rotiphorese Gel30", гліцин, ізопропіловий спирт (Сarl Roth GmbH, Німечч
- Київ+380960830922