розділ 2.6.5), об’єднували
та висаджували 100% етанолом. Висушені за допомогою вакууму осади розчиняли в
буфері Е й зберігали при -20оС.
2.6. Методи охарактеризування біологічних макромолекул.
2.6.1. Метод обмеженого трипсинолізу eEF1А. Модифікований трипсином фактор
елонгації 1А з печінки кроля отримували, додаючи 4 мкг
N-тозил-L-фенілаланілхлорометилкетон-обробленого трипсину до 250 мкг
високоочищеного eEF1A, що знаходився в буфері В, в присутності 8 мМ ГТФ та 15%
гліцерину при температурі 18оС протягом 2 годин. Протеоліз зупиняли додаванням
інгібітора трипсину – 2 мМ фенілметилсульфонілфлюорида (PMSF). Ступінь
розщеплення визначали за допомогою електрофорезу. Електрофорез проводили в
буферній системі Лемлі в денатуруючих умовах в поліакріламідному гелі [152].
Трипсинізований eEF1A очищували від відокремленого N-кінцевого фрагмента за
допомогою хроматографії на SP-сефарозі. Після проходження реакції трипсинолізу
eEF1A, суміш негайно наносили на колонку з SP-сефарозою, що була передчасно
врівноважена буфером В. Після нанесення суміші трипсинізованого ДeEF1A колонку
промивали буфером В з 300 мМ KCl (для звільнення й очищення від надлишку ГТФ та
N-кінцевого фрагменту). Білок елюювали та концентрували за допомогою буферу В,
що містив 1М KCl. Для звільнення від великої концентрації KCl, розчин білку
діалізували впродовж 4 годин з двома змінами буферу В. Розчин трипсинізованого
ДeEF1A зберігали в рідкому азоті в буфері В.
2.6.2. Реакція ГТФ/ГДФ обміну в молекулах eEF1А чи ДeEF1A.
2.6.2.1. Визначення рівня зв’язування [3H]ГДФ та [3H]ГТФ з eEF1A та ДeEF1A. 4
пмоль eEF1A чи ДeEF1A інкубували протягом 15 хвилин при 37оС з 2 нмоль
[3H]ГДФ/[3H]ГТФ в буфері Ж (50мМ Трис-HCl, pH 7,6, 100мМ NH4Cl, 10мМ MgCl2, 1мМ
ДTT, 10мг/мл БСА, 25% гліцерин, 50мМ KCl). Реакцію зупиняли додаванням 1 мл
холодного розчину буферу З: 20мМ Трис-HCl, рН 7,5, 10мМ MgCl2, 100мМ NH4Cl,
10мМ в-меркаптоетанол. Розведені зразки негайно наносили на нітроцелюлозні
фільтри (“Sartorius”) з розміром пор 0,45 мкм й тричі промивали 1 мл буфера Г.
Фільтри висушували й поміщали в толуоловий сцинтиллятор “Optiphase”. Вміст
радіоактивності сухих фільтрів визначали в толуоловому сцинтиляторі на
лічильнику RackBeta 1219. Ефективність підрахунку [3H] на фільтрах складала
26%.
2.6.2.2. Визначення швидкості дисоціації комплексів eEF1A та ДeEF1A з ГТФ та
ГДФ. Подвійні комплекси eEF1A•ГТФ/ГДФ та ДeEF1A•ГТФ/ГДФ формували при інкубації
0,08 нмоль білку з 2 нмоль [3H]ГДФ протягом 15 хвилин при 37оС в буфері Ж.
Потім суміш, що містила комплекс білка з [3H]ГДФ чи [3H]ГТФ, охолоджували при
4оС протягом 5 хвилин.
Реакцію дисоціацію починали, додаючи 150-кратний надлишок неміченого ГДФ чи
ГТФ. Зразки об’ємом 60 мкл відбирали з загальної суміші через певні проміжки
часу й фільтрували крізь нітроцелюлозні фільтри (діаметр пор 0,45 мкм) з
використанням буфера З. Радіактивність визначали як вказано в пункті 2.5.4.1).
2.6.3. Метод затримки смуги в гелі комплексів eEF1A*ГДФ*тРНКФен та
модифікованого трипсином eEF1A*ГДФ*тРНКФен. 10 пмоль [32P]тРНКФен інкубували
при 37оС в присутності різних концентрацій eEF1A та ДeEF1A (від 10 до 2 мкМ
білка) в буфері, що містив: 25 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 2 мМ MgCl2, 25 мМ KCl, 25%
гліцерин, 2 мМ ДTT, 100 мкМ ГДФ. Далі для аналізу утворення комплексів
проводили нативний електрофорез в 5%-му ПААГ при 20 В/см2 в буфері, що містив:
50 мМ Трис-борат, рН 7,5, 1мМ ЕДТА, при температурі 4оС протягом 2 годин.
Радіоавтографію гелю проводили за допомогою рентгенівської плівки протягом 1-3
діб при 4оС.
2.6.4. Аміноацилювання індивідуальної дріжджової тРНКФен. Аміноацилювання
індивідуальної дріжджової тРНКФен проводили в буфері, що містив: 30мМ
імідазолу, рН 7,6, 10 мМ MgCl2, 100 мМ КСl, 3мМ ДTT , 3мМ АТФ, pH 7,0, 60мкМ
[14C]Фен, при концентрації індивідуальної фенілаланінової АРСази з печінки
кроля 0,125мг/мл. Концентрація індивідуальної дріжджової тРНКФен становила
1мг/мл. Інкубацію суміші проводили при 37оС протягом 15 хвилин. Після цього до
реакційної суміші додавали 1/10 частину від обєму суміші 3М розчину CH3COONa,
рН 5,0 та 1 об’єм насиченого фенолу. Ретельно перемішували та центрифугували
при температурі 4оС протягом 10 хвилин при 12000 g. Після, відбирали верхню
водну фазу та висаджували за допомогою 2,5 об’ємів охолодженого 96% С2Н5ОН при
-20оС протягом 1 години. Суміш центрифугували при температурі 4оС протягом 30
хвилин при 12000g. Отриманий осад промивали ще раз за допомогою 70% С2Н5ОН та
центрифугували при температурі 4оС протягом 10 хвилин при 12000g. Осад
висушували за допомогою вакууму, розчиняли в буфері Е для високоефективної
рідинної хроматографії HPLC-Gold system. Хроматографію фенілаланіл - тРНК
проводили як описано в розділі 2.5.5.
Фракції, де було зафіксовано найбільшу радіоактивність, об’єднували та додавали
2,5 обєми 96% С2Н5ОН та 1/10 об’єму 3М розчину CH3COONa, рН 5,0, й висаджували
при -20оС протягом 1 годин 30 хвилин. Аміноацильовану [14C]Фен-тРНКФен
висаджували за допомогою центрифугування при 10000g протягом 1години при 4оС.
Осад висушували за допомогою вакууму та розчиняли в буфері Е.
2.6.5. Аміноацилювання сумарної тРНК з печінки бика. Реакцію аміноацилювання
сумарної тРНК з печінки бика проводили в буфері, що містив: 30 мМ імідазол, pH
7,5, 5 мМ MgCl2, 100 мМ КСl, 3 мМ ДTT, 3 мМ АТФ, pH 7,0, 40 мкМ [14C]Фен. До
120 мкг сумарної тРНК додавали 200 мкг препарату сумарних аміноацил- тРНК-
синтетаз, очищених з печінки кроля. Реакцію аміноацилювання проводили 15 хвилин
при 37оС з подальшим охолодженням на водяній бані.
2.6.6. Трансляція полі-(U) матриці в безклітинній системі, зібраної з окремих
- Київ+380960830922