РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Молекулярне моделювання
2.1.1. Віртуальний скринінг комбінаторних бібліотек низькомолекулярних органічних сполук.
2.1.1.1. Прграмне та технічне забезпечення. Для передбачення біологічної активності низькомолекулярних сполук використовувалась система віртуального скринінгу, схему якої подано на рис. 2.1.
Рис. 2.1. Схема системи віртуального скринінгу
Авторську програму SCREENER було використано для конвертації двохвимірних структур лігандів у тривимірні. Розрахунок геометрії лігандів проводився за допомогою авторської програми TOPBUILDER і напівемпіричного розрахункового методу АМ1 пакету квантово-механічних розрахунків GAMESS [99]. Оптимізацію просторової структури СК2 людини було проведено в вакуумі за допомогою алгоритму крутого спуску (steepest descent) силовим полем GROMOS87, реалізованим у пакеті молекулярної динаміки GROMACS [100]. Часткові заряди атомів рецептора були розраховані силовим полем AMBER у програмі HyperChem. Для молекулярного докінгу та скорингу лігандів було використано пакет програм DOCK 4.0.
2.1.1.2. Підготовка рецептора. Для рецептор-орієнтованого гнучкого докінгу був використаний пакет програм DOCK. DOCK потребує наступні вхідні файли просторової структури рецептора: а) повна структура рецептора у форматі MOL2 з присвоєними частковими атомними зарядами б) координати амінокислотних залишків активного сайту рецептора у форматі PDB. Просторову структуру каталітичної субодиниці СК2 (рецептор) було взято з бази даних Brookhaven Protein Data Bank (ID: 1JWH) [10]. На першому етапі проводили мінімізацію енергії молекули рецептора у вакуумі за допомогою пакету програм GROMACS у силовому полі GROMOS87 (1000 кроків мінімізації, алгоритм крутого спуску). Далі розраховували часткові атомні заряди силовим полем AMBER.
2.1.1.3. Підготовка молекул лігандів проводили за допомогою авторської програми SCREENER, зокрема препроцесинг вихідного файлу бази даних лігандів, конвертацію 2D структур в 3D. Пакет програм GROMACS застосовувався для швидкої мінімізації енергії, пакет GAMESS - для оптимізації геометрії та розрахунку часткових атомних зарядів. Програма TOPBUILDER була використана для генерації молекулярних топологій у форматі GROMACS, контролю мінімізації енергії лігандів у GROMACS, присвоєння часткових атомних зарядів, розрахованих в GAMESS, генерації фінальних координат лігандів у форматі MOL2.
2.1.1.4. Гнучкий докінг. Сфери активного сайту (точки докінгу) були розраховані програмами sphgen (пакет DOCK) та Connolly MS. В процесі розрахунку сфер радіус проби складав 1,4 A, густина поверхні складала 5,0 точок. З кластеру, який описував активний сайт СК2 і налічував 37 сфер, було відібрано 31 сферу. 6 сфер було видалено, оскільки їх координати знаходились за межами активного сайту і могли спричинити появу нонсенсних позицій та конформацій ліганда. Карти контактних, енергетичних та шумових решіток рецептора були згенеровані програмою Grid пакету DOCK. Роздільна здатність решітки складала 0,5 A, максимальна дистанція урахування енергетичних взаємодій складала 10 A. Електростатичні взаємодії розраховувалисть із застосуванням відстань-залежної діелектричної константи, діелектричний фактор складав 4 з величиною відсічки 12 A. Структура рецептора описувалась повноатомною моделлю. Ротабельні зв'язки та якірні елементи молекул лігандів ідентифікувались програмою DOCK у автоматичному режимі. Конформаційний пошук здійснювався за допомогою торсійного драйву, величина шумового перекривання складала 0,3. Множинні якірних елементи у структурі ліганду були дозволені, мінімальна кількість атомів кожного елементу складала 4. Орієнтаційний пошук було здійснено застосувуючи автоматичне співпадання. Максимальне число орієнтацій складало 500. Було дозволено локальну мінімізацію та ре-мінімізацію енергії орієнтацій та конформацій ліганда і його якірних елементів. Параметри мінімізації енергії були взяті за умовчанням. Після кількох пробних експериментів гнучкого докінгу виявилось, що реалізація "гнучкості" для структур лігандів що містять певні типи ротабельних зв'язків є не повною, і такі ліганди, маючи недостатньо обертальних та поступальних ступенів свободи, спричиняли появу неправильних конформацій та орієнтацій у активному сайті. Параметри дефініції ротабельних зв'язків та їх дозволених кутів обертання контролюються у програмі DOCK файлами flex.defn та flex_drive.tbl. Для подолання цієї проблеми у відповідний файл flex_drive.tbl було прописано додаткові параметри (табл. 2.1). Групам carboxyl-sp3, arom-oxygen, conj-oxygen, arom-sulfur, conj-sulfur та silicon-sp3 (файл flex.defn) було присвоєно ідентифікаційний номер (ІН) 6 еквівалентний шести значенням торсійних кутів -150 -90 -30 30 90 150. Групам sp2-aromatic та acetyl-sp2 були присвоєні ІН 12 та 15 відповідно. Також додатково було введено дві нові групи aromatic-aromatic та sulfone-amide з ІН 12 та 2 (2 значення 0 180). За рахунок вказаних модифікацій було значно поліпшено точність розрахунків, але разом з тим збільшено розрахунковий час для дискретної процедури докінгу.
Таблиця 2.1
Додаткові значення торсійних кутів що були внесені у файли flex.defn та flex_drive.tbl для покращення докінгу
Ідентифікаційний номер (ІН)Число позиційДозволені значення торсійних кутів, о1212-30 30 150 -150 15 -15 165 -165 45 -45 135 -135158-30 30 150 -150 15 -15 165 -165
Отримані енергії зв'язування ліганду з рецептором, що лежать в межах від -14 до -61 Ккал/моль, були використані для вибору потенційно активних сполук з метою їх подальшого біологічного тестування.
2.1.2. Молекулярна динаміка комплексів СК2-інгібітор у водному оточенні. Розрахунок молекулярної динаміки комплексів СК2-інгібітор (рецептор-ліганд) було проведено використовуючи пакет програм GROMACS. Топології лігандів (формат файлів gro та itp ) будували за допомогою програми TOPBUILDER. Часткові атомні заряди лігандів розраховувались напі