ГЛАВА 2
Методологическая часть
Генетические изменения, вовлеченные в опухолевый процесс, могут быть идентифицированы на уровне фенотипа клетки, на уровне ДНК, РНК или белка. Классические методики поиска генов, задействованных в канцерогенезе, основывались на выявлении геномных изменений, таких как мутации, хромосомные аберрации, потеря гетерозиготности. Однако, несмотря на огромные усилия и определенные успехи, сравнительно мало было идентифицировано генов, участвующих в процессах малигнизации. Опухолевые гены вовлечены в регуляцию широкого спектра нормальных клеточных функций, включая клеточную пролиферацию [114], репарацию ДНК [115], стабильность хромосом [116], межклеточные взаимодействия [117], взаимодействия клетки и матрикса [118], ангиогенез [119], инвазию [120] и метастазирование [121], старение [122], апоптоз [122]. И хотя мутации лежат в основе канцерогенеза, по меньшей мере, на его ранней стадии, огромное количество экспрессионных изменений является основой опухолевого фенотипа [112].
Экспрессионная генетика представляет собой концептуально новый подход в изучении молекулярно-генетических основ раковых заболеваний [120]. Измененная экспрессия генов может обеспечить инициацию и прогрессию неоплазии (онкогены) или ингибировать ее (гены-супрессоры опу-холей). Экспрессия индивидуальных генов может быть изменена или через мутацию или через изменения в их регуляции. Эта дихотомия, вначале определенная в классических исследованиях генетики бактерий (мутация и адаптация b-галактозидазы), дает основания для группирования опухо-левых генов в два класса: гены I класса, - мутированные или делетированные, в то время как гены II класса, - не измененные на уровне ДНК, а воздействуют на фенотип изменениями их экспрессии [123].
Экспрессия генов на уровне белка может отличаться от таковой на уровне РНК посттранскрипционными и посттрансляционными модификациями, однако скрининг на уровне РНК остается наиболее мощным методом, приемлемым для определения большого набора дифференциально экспресирующихся генов [123].
Для идентификации дифференциально экспрессирущихся генов и детекции уровня их экспрессии используются различные подходы, такие как дифференциальная гибридизация, супрессивная субтрактивная гибридизация, дифференциальный дисплей-полимеразная цепная реакция (дд-ПЦР), цифровой дифференциальный дисплей (DDD), серийный анализ экс-прессии генов (SAGE), ДНК микрочипы, FISH мРНК [124-130]. Каждый из этих методов имеет свои преимущества и недостатки, поэтому авторы используют их в различных сочетаниях в зависимости от поставленной задачи.
2.1. Субтрактивная гибридизация
Хотя имеется несколько модификаций этого метода [131, 132], прин-цип метода остается неизменным - удаление общих транскриптов в виде двухцепочечных гибридов посредством гибридизации в растворе. Субтрактивная (вычитательная) гибридизация основана на том, что кДНК, синтезированная на мРНК из клеток/ткани мишени, гибридизуется с 20-кратным (или большим) молярным избытком "приводной" мРНК из контрольных клеток/ткани с последующим отделением двухцепочечных гибридов (общих мРНК) от одноцепочечных кДНК (дифференциально экспрессирующихся мРНК) хроматографией на гидроксиапатите, фенольной экстракцией стрептавидин-биотинового комплекса или при помощи магнитных шариков. Полученная одноцепочечная ("вычтенная") кДНК используется как меченая проба для скрининга библиотек или для конструирования "вычтенной" библиотеки кДНК. При вычитательной гибридизации элиминируются общие для сравниваемых популяций транскрипты и обогащаются нуклеотидные последовательности, специфичные для изучаемой ткани. Предварительно, мРНК одного из пулов (обычно опухолевая) метится: специальными ДНК адапторами, биотинилируется или химически модифицируется, затем проводят гибридизацию (обычно два раунда) и ПЦР [126].
Эта методика была оптимизирована, и теперь возможно конструирование субтрактивной кДНК библиотеки из нанограмовых количеств одноцепочечной кДНК, полученной в результате гибридизации в растворе.
Вычитательная гибридизация является эффективным методом для создания библиотек кДНК, зондов для дифференциальной гибридизации и выявления тканеспецифических генов. При помощи этого метода были выявлены гены, меняющие экспрессию в гепатоклеточной карциноме [133]; в карциноме предстательной железы [134]; а также гены, участвующие в клеточном цикле [135] и запрограммированной смерти клеток [136].
2.2. Дифференциальный дисплей - полимеразная цепная реакция
Дд-ПЦР позволяет идентифицировать дифференциально экспрессирующиеся гены в различных in vivo и in vitro системах. Этот метод не зависит от знания сиквенса и наличия кДНК клонов, но утрачивает количественный компонент Нозерн-блота или количественного ПЦР [127, 137].
Метод объединяет обратную транскрипцию мРНК с использованием одного из набора "поли(А)-заякоренных" праймеров - олиго(dT)MN, где MN - комбинация динуклеотидов: AA, AT, AC, AG; CA, CT и т.д.) и по-следующую амплификацию полученного продукта кДНК при помощи полимеразной цепной реакции с использованием того же самого "заякоренного" праймера и одного из набора статистических праймеров (10-мерных олигодезоксирибонуклеотидов) [127]. Амплифицированные субпопуляции кДНК (преимущественно неполноразмерные, комплементарные 3'-кон-цевым участкам мРНК) затем разделяются на соседних дорожках электрофорезом в денатурируещем полиакриламидном геле и различия в наборах кДНК сравниваемых клеток визуализуются ауторадиографией. Комбинация большого количества "заякоренных" праймеров и статистических 10-меров увеличивает количество выявляемых отличий в сопоставляемых популяций мРНК из нормальных и опухолевых тканей. Полосы кДНК, характерные для нормальных или опухолевых клеток, вырезаются из геля, амплифицируются с использованием соответствующих праймеров, клонируются и анализируются.
При дифференциальном дисплее неполноразмерные кДНК, продуцируемые ОТ-ПЦР произвольно праймированных мРНК, идентифиц