РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Експериментальні тварини
В дослідженнях, які присвячені вивченню механізмів виникнення, розвитку і припинення епілептиформної активності переважним об'єктом дослідження є мозок щура [251]. Раніше, основні закономірності епілептизації мозку були виявлені на даному експериментальному об'єкті, були підтверджені при формуванні кіндлінга і відтворенні інших видів епілептиформної активності у тварин інших видів, у тому числі на кішках [75, 252, 253]. Виходячи зі сказаного, а також ґрунтуючись на цілях і задачах даного дослідження, у даній роботі в якості експериментальних тварин були обрані щури-самці лінії Вістар.
Робота з експериментальними тваринами провадилася у відповідності до вимог, викладених в "Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с экспериментальными животними" (1985).
Експериментальна частина досліджень проводилася за умов гострого і хронічного експерименту на 284 білих статевозрілих щурах лінії Віcтар вагою від 200 до 220 г і 40 щурів віком 30 днів вагою від 30 до 40 г. Тварин розміщували в індивідуальних боксах c природною зміною світла і темряви, з вільним доступом до води і їжі. З метою приручення, щурів перед початком експериментів тримали в руках 2-3 хв протягом 5 днів, що полегшувало наступні експериментальні дослідження з тваринами [254].
2.2. Особливості введення пілокарпіну
Пілокарпін готували в розчині NaCl (p=7,4) безпосередньо перед початком досліджень і вводили внутрішньочеревно дозою 280 мг/кг. Тваринам контрольної групи вводили еквівалентний об'єм фізіологічного розчину. Час спостереження за щурами після введення пілокарпіну складав 3 години. Судоми у щурів спостерігали в середньому протягом 2-3 год. Гострі пілокарпін-викликані генералізовані судоми розвивалися, як правило, протягом 20 хв і тривали протягом 2 годин (цей часовий інтервал складав іктальний період (рис. 2.1). Потім з латентним періодом, у середньому, 30 хвилин розвивалися мимовільні судоми, що дозволило нам цей інтервал часу (30 хвилин) оцінити як інтеріктальний період (рис. 2.1.).
Пілокарпін
Іктальний періодІнтеріктальний період
20 хвилин
120 хвилин
150 хвилин Рис. 2.1. Похвилинна схема організації досліджень по вивченню іктальних і інтеріктальних поведінкових порушень у щурів за умов пілокарпін-викликаної хронічної ЕпА.
В окремій серії дослідів за 3 хв до введення пілокарпіну щурам внутрішньочеревно вводили атропін дозою 50 мг/кг.
2.3. Гострий генералізований судорожний синдром
Для відтворення нейрoтoкcичних ефектів у роботі використовували агoніcт рецепторів збудливих амінокислот каїнову кислоту, яка викликає глибокі метабoтрoпні зміни в нейронах [31, 253-257]. Характерною ознакою нейротоксичної дії цієї речовини є розвиток стійкої деполяризації мембрани нейронів, що передує їх загибелі.
Генерализoвані cyдoми, викликали за допомогою каїнової кислоти використовуючи розчин, який містив 1 мг препарату в 1 мл. Каїнову кислоту розчиняли в 0.9% фізіологічному розчині NаСl і вводили внутрішньочеревно дозою 15 мг/кг (дорослим щурам) і 5 мг/кг (30-денним щурам): розчини готували безпосередньо перед введенням. Крім того, для індукції гострих генералізованих судом у дорослих щурів використовували також пікротоксин (2.0 мг/кг, в/чер, дорослим щурам і 1 мг/кг - 30-денним щурам), конвульсивні ефекти якого пов'язані з порушенням ГАМК-ергійного гальмування [258].
Ефекти конвульсантів реєструвалися візуально протягом 30 хв після їх застосування й оцінювали в такий спосіб: 0 балів - відсутність судорожної реакції; 1 бал - міоклонічні здригування голови або тулуба; 2 бали - клонічні судоми м'язів тулуба і кінцівок; 3 бали - підйом на задні кінцівки ("поза кенгуру"), повторні клонуси м'язів передніх кінцівок; 4 бали - генералізовані клоніко-тонічні судоми c падінням тварин убік, вегетативними розладами і постприступної депресією; 5 балів - смертельні судоми або повторні генералізовані клоніко-тонічні напади [71, 91, 152].
Крім того, визначали латентний період перших судорожних проявів, латентний період генералізованих клоніко-тонічних нападів, а також число тварин c генералізованими судорожними нападами.
2.4. Операційна підготовка тварин
Імплантацію електродів і канюль робили за методикою, описаною в літературі [251, 254]. Для реєстрації біоелектричної активності структур головного мозку використовували ніхромову або константанову проволоку в лаковій ізоляції з діаметром кінчика 0,10-0,15 мм. Канюлі являли собою електролітично заточені голки з нержавіючої сталі із зовнішнім діаметром 0.6 мм; довжина канюлі залежала від локалізації структури і складала, в середньому, від 5.0 до 9.0 мм. Для вживляння електродів або імплантації канюль тварин наркотизували за допомогою внутріочеревинних ін'єкцій нембутала (30-35 мг/кг) або гексенала (100 мг/кг) і фіксували в стереотаксичному апараті Ковача (Угорщина).
Після фіксації голови тварини здійснювали інфільтрацію м'яких тканин голови та області зовнішнього слухового проходу 0.5% розчином новокаїну. Стереотаксичну імплінтацію електродів і канюль через висвердлені за допомо-гою бор-машини БЕМ-06М трепанаційні отвори проводили у відповідності до атласу L.Kruger (1995) по таких координатах [259]: фронтальна кора великих півкуль - АР=2,4; L=0,8; H=1,2; тім'яна кора великих півкуль - АР=0,8; L=1,5; H=1,4; потилична кора великих півкуль - АР=-4,6; L=1,3; H=1,4; чорна речовина - АР=-4,8; L=2,5; H=8,0; вентральний гіпокамп - AP=-4,8; L=4,5; H=7,0; мигдалик - АР=-2,5; L=5,0; H=8,0; хвостате ядро - АР=+0,8; L=3,0; H=4,5;. Реєстрацію електричної активності, внутрімозкові введення препаратів і вивчення поведінкових реакцій здійснювали через 7-10 днів після стереотаксичних втручань.
Для оцінки ЕЕГ використовувалася частота опитування 256 імп/с за допомогою АЦП (National Instruments, USA) - дані відображалися на екрані і записували на твердий диск для наступної off-li