РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Експериментальні тварини та методика моделювання цукрового діабету
Дослідження проводилися на 150 самцях щурів лінії Вістар масою 230-250г. Тварини знаходилися в умовах природного висвітлення при вільному доступі до води і їжі. Досліджувані тварини були розділені на 12 експериментальних груп: тварини з експериментальним діабетом тривалістю плину від однієї до п'яти тижнів (групи 2-6), тварини з цукровим діабетом, яким інтрацеребровентрікулярно і інтраперітонеальні вводили нейропептида Y (групи 9 і 10) і окситоцин (групи 11 і 12). Контрольними групами були тварини, яким однократно інтраперітонеально вводили 0,5 мл 0,1 М цитратного буфера (рн=4,5) (група 1), а також інтрацеребровентрікулярно і інтраперітонеально вводили 0,9% розчин NaCl (групи 7 і 8). Кількісний розподіл тварин в експериментальних групах представлено в таблиці 2.1.
Для ініціації цукрового діабету тваринам вводили стрептозотоцин (2- дезоксиметіл-нітрозомочевина-глюкозопіраноза), що володіє специфічною b- цитотоксичною дією. Вважають, що нітрозомочевина, що входить до складу стрептозотоцина, забезпечує токсичу дію препарату, а 2- дезоксиглюкоза - b-цитотропність [91, 239]. У ?-клітинах стрептозотоцин викликає утворення розривів у молекулах ДНК, що призводить до активації процесів ядерного полі-АДФ-риболізіровання, що, у свою чергу, викликає різке зниження рівня внутрішньоклітинного НАД і загибель клітини [83, 130]. По гормонально-метаболічних змінах у тварини діабет, індукований стрептозотоцином, багато в чому подібний цукровому діабету 1-го типу в людини., а ступінь ваги плину патологічного процесу характеризується чіткою залежністю від застосовуваної дози препарату [3, 130, 231, 239].
Стрептозотоцин (SIGMA Chemical, США) вводили однократно внутриочеревинно в дозі 50мг/кг, розчиненної в 0,5 мл 0,1 М цитратного буферу (рн=4,5) перед самою дією уведення. Час, що пройшов із дня введення препарату, надалі у викладі матеріалу інтерпретувался як тривалість плину діабету. У всіх тварин у сироватці крові до введення стрептозотоцину і на всіх етапах моделювання цукрового діабету визначалася концентрація глюкози в крові глюкозо-оксидазним методом за допомогою глюкометра One Touch II (США). В експеримент відбирали тільки тих тварин, у яких спостерігався розвиток гіперглікемії на 1-й тижню після введення препарату.
Таблиця 2.1
Розподіл тварин в експериментальних серіях
Серії дослідженьКількість
тварин1. Інтактні тварини (контроль)122. Цукровий діабет (1 тиждень)123. Цукровий діабет (2 тижня)124. Цукровий діабет (3 тижня)125. Цукровий діабет (4 тижня)126. Цукровий діабет (5 тижнів)127. Цукровий діабет (5 тижнів) з інтрацеребровентрікулярним уведенням 0,9% розчину NaCl128 Цукровий діабет (5 тижнів) з інтраперітонеальним уведенням 0,9% розчину NaCl129. Цукровий діабет (5 тижнів) з інтрацеребровентрікулярним уведенням NPY1210. Цукровий діабет (5 тижнів) з інтраперітонеальним уведенням NPY1211. Цукровий діабет (5 тижнів) з інтрацеребровентрікулярним введенням окситоцина1512. Цукровий діабет (5 тижнів) з інтраперітонеальним введенням окситоцина15 РАЗОМ150
2.2. Методика введення нейропептидів
У роботах кафедри патофізіології під керівництвом завідувача кафедрою, д.м.н., професора Колесника Ю.М. проводилися багаторазові інтрацеребровентрікулярні та інтраперітонеальні введення синтетичних аналогів нейропептида NPY і окситоцину, що стимулювали синтез інсуліну в b- клітинах панкреатичних острівців і значно знижували рівень глікемії у діабетичних тварин [ 1, 2, 3, 4, 9, 10, 56, 60, 66, 67, 68, 108, 110]. Підбор доз для введення нейрогормонів здійснювався на підставі данних літератури [2] і попередніх експериментів, проведених на кафедрі патофізіології Запорізького медичного університету. Використовувалися пептиди виробництва фірми Peninsula Laboratories Ins., США.
Так, згідно [1, 2], при інтрацеребровентрікулярному введенні в дозах, що перевищують 10 мкг, NPY стимулює споживання їжі і викликає розвиток ожиріння. Виходячи з цього, в нашій роботі ми використовували більш низьку дозу NPY, уведення якої не викликало зазначені ефекти.
Для інтрацеребровентрікулярного введення нейропептидів тваринам попередньо імплантували канюлю в правий латеральний шлуночок мозку під етаміналовим наркозом (35 мг/кг внутриочеревинно) за допомогою стереотаксичного апарата THORAX (Угорщина). Тварин фіксували в такому положенні, при якому лінія різців була на 3,3 мм нижче міжвушної лінії. Сталеву стерильну канюлю (калібр G=27) занурювали в мозок по координатах нижнього зрізу канюлі: 8,5 мм уперед міжвушної лінії, 1,5 мм вправо від середньої лінії, 4,0 мм нижче даху черепа, після чого канюлю фіксували ніхромовим дротом до гребенів кісток черепа і фіксували зубною швидкозатверджувальною пластмасою, а верхній зріз канюлі закривали стерильним ковпачком. На 8-й день після операції тварин відбирали в експеримент.
Нейропептиди вводили в обсязі 3 мкл водяного розчину 0,9% NaCl один раз на добу (з 10 до 12 годин) протягом 10 днів. Щоденна доза нейропептидів складала: синтетичного окситоцину - 0,3 нм, NPY- 2,3 пм.
Багаторазове інтраперітонеальне введення нейрогомонів здійснювали внутриочеревинно протягом 10 днів. Щоденна доза гормонів, що вводяться, складала: для окситоцина - 3 нм у 0,5 мл 0,9% NaCl, для NРY-0,6 нм у 0,5 мл 0,9% р-ра NaCl.
Контрольним тваринам цій і попередніх груп інтраперітонеально і інтрацеребровентрікулярно протягом 10 днів у тому ж обсязі вводили 0,9% розчин Nасl
2.3. Методи дослідження лімфоїдної популяції вилочкової залози. Вивчення морфометричних і денситометричних характеристик лімфоїдних клітин вилочкової залози
Експериментальних тварин в останній день досліджень позбавляли їжі і наступного дня (після 16 годин голодування) декапітували під наркозом (етамінал натрію 40 мг/кг внутриочеревинно). Вилочкову залозу швидко