РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Мета та завдання цієї роботи диктують необхідність вибору адекватних, інформативних, достовірних та сучасних методів дослідження.
2.1. Лабораторні тварини та моделювання експерименту
Експериментальні дослідження проведені на 480 статевозрілих білих щурах-самцях лінії Вістар масою тіла 180-200 г. Тварини утримувались на звичайному раціоні у стандартних умовах віварію. Всі тварини були розподілені на слідуючі групи: 1) інтактні (контроль); 2) на фоні тривалої депривації сну; 3) у післястресовому періоді; 4) на фоні тривалої дії ?-опромінення; 5) ?-опромінені тварини, у яких потім викликали депривацію сну; 6) стресовані тварини на фоні введення гептралу; 7) радіаційно уражені тварини, яким вводили гептрал; 8) ?-опромінені тварини на фоні депривації сну, яким вводили гептрал.
Як модель хронічного стресу вибраний метод тривалої (на протязі 4-х діб) депривації сну ?185?. Тварин розміщували на обмеженій площині, оточеній водою, з обмеженим доступом до їжі. При цьому, стресовий вплив носив комбінований характер (голод, холод, ізоляція, імобілізація, емоційний стрес, специфічний компонент тривалого безсоння). Зазначений метод відтворення хронічного стресу є найбільш фізіологічним і отримав широке поширення в експериментальних дослідженнях ?59, 62, 72?. Він дозволяє отримати вірогідні і стабільні зміни інтегральних показників функціонального стану організму при переході стадії стресу із стадії компенсації у декомпенсацію, або надлишково-катаболічну стадію ?44, 62?. З метою досягнення однорідності експерименту щурів-самців відбирали високоемоційного поведінкового типу, згідно тестування по "відкритому полю" ?1?. До експерименту тварин 2 групи брали на 1, 2, 3 та 4 добу депривації сну. Тварин 3 групи брали через 1, 7 та 14 діб по завершенні чотирьохдобової депривації сну. Такий підхід, на наш погляд, дозволяє оцінити адаптивні спроможності організму до дії стресового фактору та визначити термін відновлення його функціонального стану.
На сьогодення відомо ?11, 12?, що тривалий вплив тотального ?-опромінення у низьких дозах викликає в ураженому організмі реакцію, що перебігає по типу стресу, яка одержала назву радіаційного стресу ?12, 13?. Для відтворення цієї моделі стресу експериментальних тварин піддавали фракціонованому тривалому ?-опроміненню. Опромінення тварин проводили на базі Одеського обласного онкологічного диспансеру на телегамматерапевтичній установці "Агат" за слідуючих технічних умов: Ра=107 рад/хв; поле 20х20 см; ВПД=75 см; СОD=1,0 Гр; разова доза 0,1 Гр; час експозиції 6 сек; інтервал між опроміненням 72 год; кількість повторностей - 10. До експерименту тварини цієї групи брали через 1, 2, 3, 4, 5, 7 та 14 діб по завершенню дії радіаційного фактору. Модель сумісної дії депривації сну та ?-опромінення низької інтенсивності відтворювати слідуючим чином: через годину по завершенні ?-опромінення, згідно вищенаведеної схеми, тварин залучали до експерименту по депривації сну. Тварин цієї групи брали через 1 добу, 2, 3 та 4 доби депривації сну, а також через 1, 7 та 14 діб після завершення депривації сну. За 12 годин до депривації сну, а потім щодобово на протязі 7 діб тваринам внутрішньочеревинно із розрахунку 5 мг/кг маси тіла вводили гептрал (S-аденозил-L-метионін 1,4-бутансульфонат). Опроміненим щурам гептрал вводили у тій же дозі за 12 год до завершення дії радіаційного фактору, а потім щодобово на протязі 12 діб. По аналогічній схемі гептрал вводили і тваринам, що підлягали сумісній дії ?- опромінення та депривації сну. До експерименту тварин різних груп, яким вводили гептрал, брали у відповідності до термінів кожної групи без введення препарату. Евтаназію експериментальних тварин проводили шляхом швидкої декапітації у холодовій камері при температурі 0-+4 0С. Після цього проводили розтин черевної порожнини і забирали печінку, яку тричі промивали охолодженим фізіологічним розчином. Всі операції з експериментальними тваринами проводили з 8 до 9 год ранку.
2.2 Обгрунтування доцільності використання гептралу
при стрес-індукованих ураженнях печінки
S-аденозил-L-метіонін (адеметіонін) відіграє важливу роль у цілому ряді біохімічних реакцій і діє як попередник субстратів, що синтезуються у тканинах таких, як цистеїн, таурин, глутатіон і коензим А ?165?. Адеметионін є універсальним субстратом, який по важливості поступається тільки АТФ, що приймає участь у різноманітніх реакціях, особливо у трьох важливих метаболічних ланцюгах організму людини та тварин: трансметилюванні, транссульфуруванні і амінопропілюванні - або як донор групи, або як індуктор ферментів ?225?. Висока реакційна здібність адеметіоніну у цих реакціях є наслідком впливу позитивного заряду атому сірки, який сприяє розщепленню сірновуглецевих зв'язків. Одним з найбільш важливих внутрішньоклітинних детоксикуючих агентів у печінці є глутатіон, ендогенний пептид, який діє як біологічна окислювально-відновна система ?142?. Синтез і метаболізм глутатіону залежить від рівноваги шляху транссульфурування адеметіоніну через цистеїн. Дефіцит глутатіону у печінці призводить до зниження захисту клітин печінки від вільних радикалів, ендогенних та екзогенних токсичних речовин. Різні форми пошкодження печінки, у тому числі і некроз, викликаються окислювальною деструкцією та утворенням вільних радикалів. Коли кількість вільних радикалів перевершує відновну здібність глутатіону розвивається пошкодження клітин печінки. Крім того, зниження вмісту печінкового глутатіону, як наслідок пошкодження клітин печінки, веде до інактивації адеметіонінсинтетази. Це у свою чергу, сприяє порушенню реакції транссульфурування та у подальшому до зниження вмісту глутатіону ?151?. Глутатіон відіграє роль біологічного протектору адеметіонінсинтетази.
У доповнення до механізму окислення-відновення глутатіону другий метаболіт адеметіоніна - таурин відіграє важливу роль у детоксикуючій функції печінки. Таурин приймає участь у процесі ко