РАЗДЕЛ 2
Объекты и методы исследований
2.1. Экспериментальная часть работы
2.1.1. Построение экспериментальных исследований
Экспериментальную часть работы проводили для изучения механизмов участия
сфинголипидов в развитии радиорезистентности опухолевых клеток, особенностей
действия индукторов апоптоза (таксотера и этопозида) на экспрессию
сфинголипидов и роли церамидного пути апоптоза в преодолении
радиорезистентности.
Использовали биохимические, радиоизотопные, гистологические и ультраструктурные
методы.
Экспериментальной моделью опухоли служила подкожная карцинома Герена (Guerin`s
carcinoma) у крыс. В исследовании использовали 128 половозрелых крыс-самцов
линии Вистар массой 180-240 г. Эксперименты осуществляли соответственно
правилам «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых в
экспериментальных и других научных целях» и методическим рекомендациям
“Біоетична експертиза доклінічних та інших наукових досліджень що виконуються
на тваринах” [308, 309]. Трансплантацию опухоли Герена крысам осуществляли
путем введения под кожу 0,5 мл 20 % суспензии клеток, полученных из опухолевой
ткани. Штамм аденокарциномы Герена получен из Института экспериментальной
патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е.Кавецкого НАН Украины.
Эксперимент начинали на 10-е–12-е сутки после перевивки опухоли, когда размер
опухолевого узла в диаметре достигал 2,0-2,5 см.
Для изучения влияния таксотера и этопозида на обмен сфинголипидов у
крыс-опухоленосителей (карцинома Герена) использовано 56 животных. Крысы были
разделены на 4 группы:
1-я группа – 18 крыс, которым вводили таксотер в дозе 6 мг/кг массы тела и
затем определяли содержание сфинголипидов в сыворотке крови и ткани карциномы
Герена;
2-я группа – 18 крыс, которым вводили этопозид в дозе 5 мг/кг массы тела и в
последующем исследовали содержание сфинголипидов в сыворотке крови и ткани
карциномы Герена;
3-я группа – 10 крыс, которым вводили этопозид в дозе 5 мг/кг массы тела и в
дальнейшем определяли синтез церамида и сфингомиелина в опухоли Герена;
4-я группа –10 крыс, которым вводили этопозид в дозе 5 мг/кг массы тела с
последующим определением синтеза глюкозилцерамида и сфингозина в опухоли
Герена.
Препараты вводили внутрибрюшинно.
Для изучения влияния рентгеновского облучения и совместного действия облучения
и химиопрепаратов (таксотер и этопозид) на продукцию индукторов апоптоза в
ткани опухоли Герена и их содержание в сыворотке крови использовано 72 крысы.
Локальное рентгеновское облучение зоны роста опухоли проводили на аппарате
РУМ-17 в стандартном режиме облучения: сила тока (Б)=15 mA, напряжение (U)=150
кВ, фильтры 0,5 мм Сu. Коэффициент распределения поглощенной дозы в воздухе
составлял 0, 97, мощность средней поглощенной дозы – 0, 47 Гр/мин.
Облучение проводили фракционно при поглощенной дозе на фракцию 5 Гр и с
интервалом между сеансами 24 часа. Суммарная поглощенная доза облучения на зону
роста опухоли составляла 10 Гр.
В I серии экспериментов животным вводили внутрибрюшинно этопозид «Эбеве» в дозе
5,0 мг/кг массы тела за 24 часа до первого сеанса облучения.
Во II серии экспериментов животным вводили внутрибрюшинно таксотер «Рон-Пуленк
Рорер» в дозе 6,0 мг/кг массы тела за 24 часа до первого сеанса облучения.
Колебания среднего объема опухоли в группах на момент начала эксперимента не
превышали 10 %. Объем опухоли для каждой крысы в динамике эксперимента
рассчитывали по формуле (2.1).
V=(D1 Ч D2 Ч D3 Ч р )/6
где D1, D2, D3 – ортогональные диаметры опухоли в трех направлениях. Измерения
диаметра опухоли в трех направлениях делали каждые 2-е–3-е суток.
Животных распределяли методом случайного отбора следующим образом:
I серия эксперимента:
1-я группа – крысы-опухоленосители (контроль, интактная опухоль)
(9 особей);
2-я группа – локальное фракционное рентгеновское облучение опухоли
(9 особей);
3-я группа - крысы-опухоленосители+ этопозид в дозе 5,0 мг/кг массы тела (9
особей);
4-я группа - крысы-опухоленосители+ этопозид в дозе 5,0 мг/кг массы тела +
последующее локальное облучение опухоли (9 особей).
II серия эксперимента:
1-я группа – крысы-опухоленосители (контроль, интактная опухоль)
(9 особей);
2-я группа – локальное фракционное рентгеновское облучение опухоли
(9 особей);
3-я группа - крысы-опухоленосители+таксотер в дозе 6,0 мг/кг массы тела (9
особей);
4-я группа - крысы-опухоленосители+ таксотер в дозе 6,0 мг/кг массы тела +
последующее локальное облучение опухоли (9 особей).
В I и II сериях экспериментов животных брали в исследование через
24 часа после последнего сеанса облучения. В ходе эксперимента крыс умерщвляли
путем декапитации под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии.
2.1.2. Методики определения сфинголипидов в сыворотке крови и тканях
Ткань опухоли гомогенизировали в H2O для более полного разрушения клеток.
Гомогенат ткани использовали для экстракции липидов по методу Блайя и Дайера
[310]. Церамид, глюкозилцерамид, сфингозин и сфингомиелин (СФМ) разделяли с
помощью хроматографии в тонком слое силикагеля на коммерческих пластинках
Sorbfil (АО “Сорбполимер”, Россия). Эстракты липидов, предназначенные для
анализа сфинголипидов, выпаривали в вакууме и инкубировали 60 мин при 37?С в
cреде хлороформ – метанол (1:1, об/об), содержащей NaOH (0,1 М), для гидролиза
ацилглицеринов. Липиды вновь экстрагировали [310] и использовали для разделения
на классы (СФМ, церамид, глюкозилцерамид и сфингозин) в системе растворителей
хлороформ– этилацетат – изопропиловый спирт – метанол – 0,25 % KCl
(25:25:25:10:9, об/об) [311]. Липиды (СФМ, церамид и глюкозилцерамид) проявляли
в парах иода; сфингозин – с помощью 3
- Київ+380960830922