РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Експериментальні тварини
Експериментальні дослідження були проведені за умов хронічного експерименту на 510 статевозрілих щурах лінії Вістар масою 180-250 г відповідно до вказівок, викладених у "Основних методах вивчення токсичності потенційних фармакологічних препаратів" (Фармкомітет України, Київ, 2000). Роботу з лабораторними тваринами проводили із дотриманням норм проведення досліджень, прийнятих комісією по етиці проведення експериментальних досліджень ОДМУ, та правил, передбачених Європейською комісією з нагляду за проведенням лабораторних та інших дослідів за участю експериментальних тварин різних видів.
З метою приручення тварин і відсутності у них стресової реакції у відповідь на взяття їх корнцангом, щурів перед початком експерименту тримали в руках по 2-3 хв. протягом 5 днів, що полегшувало подальші експериментальні дослідження з тваринами.
З методичної точки зору дисертаційна робота спрямована на розробку профілактичних та лікувальних заходів за умов моделі СТЗ-індукованої ЕДПП. Стосовно термінологічної обумовленості, про поняття "лікування" за експериментальних умов ЦД або ДПП йдеться в низці роботі, наприклад, [74, 83, 86, 95, 97, 100, 104, 108, 122, 124, 136, 155, 165, 171, 197, 211, 234, 255, 273]. Враховуючи це, ми провели експериментальні дослідження, метою яких було дослідження ефективності лікування СТЗ-індукованої ЕДПП шляхом вживання препаратів, які блокують синтез NO.
Методологічна побудова даних досліджень пояснюється тим, що лікувальні схеми за умов даної моделі ЕДПП обумовлені застосуванням речовин, що блокують синтез NO, після 6 тижнів з моменту введення СТЗ, тобто з моменту безпосереднього початку захворювання. Профілактичні заходи здійснювалися протягом часу розвитку захворювання: з 1 по 6 тиждень після введення СТЗ.
2.2. Модель експериментальної діабетичної периферичної полінейропатії
Експериментальний цукровий діабет (ЕЦД) відтворювали у щурів при одноразовому внутрішньоочеревинному (в/очер) введенні СТЗ (60 мг/кг; "Serva", Німеччина), який розчиняли в натрієвому цитратному буфері (рН=4,5). Введення СТЗ призводить до вибіркової загибелі ?-клітин ПЗ [83]. Формування ЕЦД перевіряли на 2 добу після введення СТЗ шляхом визначення концентрації глюкози в крові щурів, отриманої з хвостової вени, за допомогою індикаторної тест-смужки ('One Touch', Німеччина; погрішність методу становила ±1 %).
Для подальших експериментів обиралися лише ті щури, концентрація глюкози в крові яких перевищувала 15 ммоль/л. Ефективність моделювання ЕЦД становила 92-95 % (в середньому лише у 1 щура із 20 концентрація глюкози в крові на 2 добу після введення СТЗ була меншою 10 ммоль/л).
За щурами спостерігали 6 тижнів без введення фармакологічних препаратів (цей часовий інтервал є достатнім для формування ЕДПП [273]), після чого розпочинали лікування. Препарати з лікувальною метою щурам з ЕДПП вводили, починаючи з 7 тижня протягом подальших 4 тижнів (до 10 тижнів досліду) одноразово, в/очер двічі на тиждень (на 2 та 5 добу), як наведено на рис. 2.1. Формування ЕДПП у підтверджували морфологічним дослідженням хвостового нерву (з цією метою кожний тиждень умертвляли по 2-3 тварини з кожної з груп).
Проведена спеціальна серія досліджень із 18 щурами, яка дозволила нам встановити наявність ЕЦД шляхом визначення рівня глюкози крові, провести гістологічне дослідження тканини ПЗ а також визначити наявність ДПП через морфологічне дослідження хвостового нерву (детально особливості морфологічного дослідження описані на стор. 45-46). ЕДПП виникла як ускладнення ЕЦД у щурів після одноразового в/очер введення СТЗ (60 мг/кг), який індукує селективну деструкцію ?-клітин ПЗ. Патологічний стан, що вивчався нами, розвивався протягом 6 тижнів з моменту ін'єкції СТЗ, що й вважалося початком захворювання.
( 5-7 діб (Введення СТЗ
( 6 тижнів (
7 тиждень
8 тиждень
9 тиждень
10 тиждень
((((ПідготовкаФормування ЕДППЛікування ЕДППАдаптація тварин до умов віварію, приручення тварин до взяття рукою експеримента-тора.За тваринами здійснюється ретельний нагляд протягом 6 тижнів формування ЕДПП. Лікувальні дії відсутні1. Визначення концентрації глюкози в крові.
2. Визначення маси тіла щурів.
3. Визначення ШПЗ по хвостовому нерву щурів.
4. Визначення концентрації нітратів/нітритів в крові щурів.
5. Евтаназія щурів. Забір крові. Приготування гомогенатів ПЗ.
6. Визначення концентрації продуктів ПОЛ та активності антиоксидантних ферментів в крові та тканині ПЗ щурів. Рис. 2.1. Схематичне зображення методологічної побудови експериментальних досліджень
по лікуванню СТЗ-індукованої ЕДПП.
Внаслідок дії СТЗ в паренхімі ПЗ відзначалися певні морфологічні зміни: для 67-80% ?-клітин характерними були некроз та загибель (рис. 2.2), у решти клітин відмічався незначний набряк із збереженнням функціональної активності (Рис. 2.3). Морфологічно певні ділянки ПЗ виглядали із розташованими поруч некротизованими та інтактними ?-клітинами.
Рис. 2.2. Некроз інсулярних клітин ПЗ у щура зі СТЗ-індукованою ЕДПП. Фарба: гематоксилін та еозин. Збільшення х 200.Рис. 2.3. Збережені (нормальні) бета-клітини ПЗ у щура зі СТЗ-індуко-ваною ЕДПП. Фарба: гематоксилін та еозин. Збільшення х 350.
Результати даної частини досліжень по веріфікації моделі ЕЦД впродовж 6 тижнів поданий в таблиці 2.1, з якої можна бачити, що у всіх досліджених щурів відмічалися гибель від 62 до 88 % ?-клітин ПЗ на 1-му тижні досліду до 73 до 92 % ?-клітин ПЗ на 6-му тижні досліду. Концентрація глюкози крові в них становила 18,4?0,9 ммоль/л на 1-му тижні та 19,1?0,5 ммоль/л на 6-му тижні досліду
Таблиця 2.1.
Дослідження кількості ?-клітин ПЗ (%) та концентрації глюкози (ммоль/л) в крові щурів
за умов СТЗ-індукованої моделі ЦД
Кіль-кість тва-
ринТижден