РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Епізоотологічний моніторинг диктіокаульозу великої рогатої худоби в Україні було здійснено шляхом ретроспективного аналізу ветеринарних статистичних даних за 1991-2000 рр. Дослідження за темою дисертації були проведені протягом 2001-2003 рр. у відділі паразитології Центральної державної лабораторії ветеринарної медицини, в районних лабораторіях ветеринарної медицини (Чуднівська Житомирської області та Вишгородська Київської області), у 6 господарствах Київської області (спільне підприємство імені Т.Г. Шевченка та спільне підприємство "1 травня" Васильківського району, відкрите акціонерне товариство "Прогрес", спільне товариство з обмеженою відповідальністю "Деснянський", спільне підприємство імені Ватутіна, спільне торгове підприємство "Катюжанка" Вишгородського району) і 10 господарствах Житомирської області (спільне товариство з обмеженою відповідальністю "Корчицьке", спільне товариство з обмеженою відповідальністю "Надія", спільне товариство з обмеженою відповідальністю "Трощаївське", спільне товариство з обмеженою відповідальністю імені Семенка, приватна аграрна фірма "Лан", приватне аграрне товариство імені Косовського, спільне торгове підприємство "Урожай", спільне торгове підприємство "Хлібороб", виробниче аграрне товариство "Коровенецьке", приватне об'єднане спільне товариство "Україна" Чуднівського району), неблагополучних з диктіокаульозу, на кафедрі паразитології та тропічної ветеринарії Національного аграрного університету. Розробку та відпрацювання тест-системи "Dyctio-Test" виконували в секторі молекулярно - біологічної діагностики ДНКІБШМ Міністерства аграрної політики України.
Гельмінтоларвоскопічні дослідження проводили за Берманом і спрощеним ларвоскопічним методом (Шевцов А.А., 1979).
Для диференціації личинок диктіокаул застосовували метод Буланова: на предметне скло до осаду вносили кілька крапель 0,1% розчину метиленового синього. Препарат струшували та через 30 с проглядали під мікроскопом (БИМАМ Р-11, об'єктив 10, окуляр К 10х / 18). При цьому личинки диктіокаул набували світло-бузкового кольору, частинки калу - зеленого, рідина - блакитного.
Визначення виду гельмінтів проводили за морфологічними ознаками личинок, які наведені в атласі гельмінтів тварин [164]. При забої та ветеринарно-санітарній експертизі туш великої рогатої худоби у бронхах і трахеї виявляли статевозрілих гельмінтів Dictyocaulus viviparus у 3 трупах телят. При цьому користувались методом повного гельмінтологічного розтину трахеї і бронхів за К.І. Скрябіним (1928). Усього було обстежено гельмінтоларвоскопічним методом 233 тварини.
Теоретичну і практичну підготовку для створення методу ПЛР - діагностики диктіокаульозу великої рогатої худоби, проводили в секторі молекулярно - біологічних методів діагностики ДНКІБШМ.
Матеріалом для відпрацювання реакції були статевозрілі гельмінти і личинки Dictyocaulus viviparus. Гельмінти отримали із трахеї і бронхів хворих на диктіокаульоз тварин при розтині трупа теляти 5 міс із спільного товариства з обмеженою відповідальністю "Корчицьке" (134 нематоди). Дорослих паразитів розтирали у ступці з 5 см3 стерильного фізіологічного розчину до гомогенної маси. Личинок виділяли з фекалій при спрощеному гельмінтоларвоскопічному методі (500 екземплярів) в 1 см3 води.
Створення праймерів проводили за допомогою комп'ютерних програм Vector NTI Suite 6, Align X, FASTA і BLASTA on line.
Праймери для ПЛР на основі відомої послідовності гену Dictyocaulus viviparus на наше замовлення синтезувала науково - виробнича фірма (НВФ) "Літех" (м. Москва, Росія).
Виділення ДНК із патологічного матеріалу (гомогенна маса із статевозрілих нематод та личинки диктіокаул) проводили за допомогою "Набору реагентів для виявлення ДНК" виробництва НВФ "Літех". Для однієї проби використовували 0,05 см3 дослідного зразка. До складу реагентів входять:
1. Денатуруючий розчин для лізису клітин патологічного матеріалу та денатурації білкових компонентів і ферментів (1 флакон по 45,0 см3).
2. Промивний розчин - для відмивання залишкових компонентів білкової, вуглеводної та іншої природи (не ДНК) (1 флакон, 100,0 см3);
3. Ізопропіловий спирт для осадження нуклеїнових кислот (1 флакон по 30 см3).
4. Розчин носія (т-РНК) для зв'язування нуклеїнових кислот (1 пробірка по 0,03 см3).
5. Хлороформ для очистки білкових компонентів (1 флакон по 12,0 см3)
Набір для проведення ПЛР:
6. Реакційна суміш вміщує ПЛР - буфер, розчин дНТФ, розчин специфічних праймерів, барвник (2 пробірки по 0,6 см3).
7. Taq-полімераза - фермент необхідний для синтезу компліментарних ланцюгів ДНК (1 пробірка з 0,025 см3).
8. Масло мінеральне для запобігання випаровування реакційної суміші під час ПЛР (1 пробірка - 4,0 см3).
9. Позитивний контрольний зразок (ПКЗ) для інтерпретації результатів ПЛР (1 пробірка - 0,1 см3).
Набір для електрофоретичного аналізу продуктів ПЛР:
10. Буфер для електрофорезу (ТВЕ), суха суміш для приготування буфера (1 флакон - 18,0 г) або концентрований розчин (1 флакон - 50 см3).
11. Агароза для електрофорезу- для приготування гелю (2 пакети (флакони) - 1,8 г).
12. Бромід етидію - для виявлення (забарвлення) ДНК у гелі (1 пробірка - 0,05 см3).
Позитивний контрольний зразок (ПКЗ) - фрагмент специфічної матриці ДНК клонований у векторі pBluescript II, фірми Stratagene, кат. № 212205; отриманий у лабораторних умовах згідно з вимогами технологічних інструкцій.
До складу розчинів входять:
- трис-НСl , фірми Sigma, кат. № Т 325;
- тритон Х-100, фірми Sigma, кат. № Т 9284;
- етилендіамінтетраоцтової кислоти динатрієва сіль (Nа - ЕДТА), фірми Sigma, кат. № Е 4884;
- гуанідинтіоціанат, фірми Sigma, кат. № G 7028;
- сіліка, фірми Sigma, кат. № S 5631;
- дезоксинуклеотидтрифосфати (дНТФ), фірми Promega, кат. № U 1240;
- праймери D.v.-1 і D.v.-2 отримані в лабораторних умовах згідно