РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об'єкти дослідження
Об'єктом дослідження слугували ВМЯ і ЛГО щурів-самців лінії Wistar трьох
вікових груп – дорослі (8 міс), старі (27 міс) і дуже старі (32 міс). У кожній
групі було по 10 тварин (5 з них досліджувалися на світлооптичному рівні, а 5 –
за допомогою електронної мікроскопії).
Імуногістохімічне визначення білка S100B у ВМЯ і ЛГО провадилося на 8-, 27- і
32-місячних щурах тієї ж лінії. У кожній віковій групі використовувалося по 4
тварин.
Ультрацитохімічні особливості активності лужної фосфатази (ЛФ) у ВМЯ і ЛГО при
старінні досліджувалися на 8- і 27-місячних щурах тієї ж лінії. У кожній
віковій групі було по 5 тварин. В якості контролю використовувалися інтактні
дорослі і старі тварини (по 5 особин для кожної реакції).
Ці ж області гіпоталамуса вивчали при моделюванні емоційно-больового стресу
(ЕБС) у дорослих (8 міс) і старих (27 міс) щурів. У кожну групу входило по 20
тварин (10 з них досліджувалися на світлооптичному рівні і 10 – на
електронномікроскопічному).
Усього в дослідженні було використано 102 щура (самці) лінії Wistar. Тварини
утримувалися в стандартних умовах експериментально-біологічної клініки
Інституту геронтології АМН України.
2.2. Світлооптичні дослідження
Для світлооптичних досліджень мозок фіксували в спирт-формолі (1 частина
нейтрального формаліну і 9 частин 96° спирту). Зневоднювання в спиртах і
заливання у парафін провадилися за загальноприйнятою методикою [36].
На ротаційному мікротомі фірми "Reichert" (ФРН) були зроблені серійні
фронтальні зрізи гіпоталамічної області завтовшки 10 мкм, що забарвлювали
тіоніном за Ніслем [35]. Довжина ВМЯ в ростро-каудальному напрямку складала
приблизно 1000-1200 мкм (100-120 зрізів). На цих же зрізах досліджувалася і
ЛГО.
2.3. Електронномікроскопічні дослідження
Для електронномікроскопічного дослідження тонкі (товщиною менш 1 мм) клинчасті
шматочки гіпоталамічної області (вершина клина містила ЛГО, основа – ВМЯ)
фіксувалися в 2,5 % розчині глютаральдегіду протягом 6 годин при температурі
+4 °С. Після цього шматочки промивалися у фосфатному буфері (pH 7,4) впродовж 2
годин і дофіксовувалися в 1 % розчині чотирьохоксиду осмію на фосфатному буфері
(pH 7,4) протягом 2 годин. Метод подвійної фіксації (попередня фіксація
глютаральдегідом з наступною дофіксацією осмієвою кислотою) дає найкращі
результати [242]. Подальше зневоднювання в спиртах і ацетоні та заливання в
смолу (епон-аралдитна суміш, складена за прописом Luft [193]) здійснювалося за
загальноприйнятим методом [53].
Різання блоків провадилося на ультратомі LKB-III (Швеція) за допомогою скляних
ножів, що готувалися на приладі Knife Maker 7801B (LKB, Швеція). Напівтонкі
зрізи (0,5-1,0 мкм) поміщалися на предметне скло в краплю 5% водяного розчину
ацетону і висушувалися, після чого їх було забарвлено толуїдиновим синім по
методу Sato і Shamoto [251]. Напівтонкі зрізи використовувалися для визначення
точної локалізації ВМЯ і ЛГО.
Ультратонкі зрізи мали товщину 50-70 нм. Товщину зрізів визначали за кольором
інтерференційних смуг [37]. Необхідні зрізи виловлювалися з ванночки і
містилися на паладієві предметні сіточки, попередньо очищені в парах хлороформу
і дихлоретану (3:1 відповідно). Фарбування зрізів провадили 2 % розчином
уранілацетату [291] і цитратом свинцю [236]. У такий спосіб досягалося найкраще
контрастування зрізів [140].
Ультратонкі зрізи досліджувалися за допомогою електронних мікроскопів JEM-100B
("Jeol", Японія) і ПЕМ-125К ("Selmi", Україна) при прискорюючій напрузі 60 кв.
Фотографування зображення робили на контрастні діапозитивні фотопластинки
(світлочутливість за ДЕСТ – 2,4 ОД), з отриманих негативів було виготовлено
електронні мікрофотографії.
Правильність показань збільшень електронного мікроскопа контролювалася за
допомогою тест-ґратки, що має 1152 лінії на 1 мм. Визначення лінійних розмірів
субклітинних структур провадилося згідно з методикою Уіклі [53].
2.4.Морфометрія
Чисельна щільність нейронів (ЧЩН) і гліоцитів (ЧЩГ) підраховувалася на тестовій
площі розміром 22500 мкм2. На ВМЯ припадала 1 тестова площа на перших
ростральних зрізах, 5-6 – у середній частині ядра і 2-3 тестові площі на
каудальних зрізах. ЛГО досліджувалася на тих же зрізах, що і ВМЯ. На ЛГО
накладалося по 2 тестові площі на одному зрізі. Кількість клітин
підраховувалася при збільшенні x280 (об'єктив x70, NA 1,23; окуляр x4) за
допомогою квадратно-сітчастої окулярної вставки.
При підрахунку ЧЩН для диференціальної оцінки кількісних змін нейронів при
старінні враховувалися їх якісні характеристики. Для цього за морфологічними
критеріями умовно виділяли 3 типи нейронів: незмінені (типові, звичайної
структури), гіперхромні і вакуолізовані (такі, що містили великі вакуолі або
клітини з ознаками хроматолізу).
При визначенні ЧЩГ враховувалися особливості взаємовідносин гліоцитів з
нейронами, а саме виразність сателітоза, що правило за важливу характеристику
їхньої функціональної ролі. Крім загальної кількості гліальних клітин
визначалася кількість вільних гліоцитів (якщо гліоцит знаходився на відстані
більш ніж 5 мкм від нейрона), а також кількість гліоцитів, що входили до складу
“поодиноких”, “парних” і “потрійних” і більше сателітних груп, розташованих
навколо нейронів.
Гліальний індекс вираховувався шляхом ділення величини ЧЩГ на ЧЩН.
Об’єм ВМЯ обчислювався за формулою: Об’ємВМЯ=(кількість зрізів
ВМЯ)*(товщина зрізу)*(сума всіх площ профілів ВМЯ). При цьому площа профілю ВМЯ
на кожному зрізі вимірювалася за допомогою відеосистеми і пакета програм для
морфометрії “MORPHOSCAN” (НВК "Єва", Київ).
- Київ+380960830922