РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Матеріали досліджень
Штами мікроорганізмів. У всіх наших дослідженнях використовувались штами
дріжджів Y. lipolytica, що не містять ретротранспозону ylT1, а саме:
штам дикого типу H222 з генотипом MATA [58];
штам H222-41 з генотипом H222 ura3-41 [72];
штам H222-S4 з генотипом H222 ura3-302::SUC2 [72];
штам PO1dL з генотипом LEU2 ura3 xpr2, отриманий доктором Жаном-Марком Ніко
(лабораторія мікробіології та молекулярної генетики Національного інституту
агрономічних досліджень м. Гріньйону, Франція);
Ura--штам MTLY40 з генотипом Дpox2, 3, 4, 5 [73];
штами Ain1-Ain41, отримані автором за допомогою інсерційного мутагенезу на базі
штаму H222-S4. У дисертаційній роботі встановлено генотип штаму Ain16 (H222-S4
trs85-1::zeta-URA3) та Ain19 (H222-S4 trs85-2::zeta-URA3);
штам N155 [72] з генотипом H222-41 ugt51::zeta-URA3, що був встановлений в
процесі виконання дисертаційної роботи;
штам ZU110 з генотипом H222-41 pmp47::zeta-URA3, отриманий доктором
Жаном-Марком Ніко (лабораторія мікробіології та молекулярної генетики
Національного інституту агрономічних досліджень м. Гріньйону, Франція).
Для ампліфікації плазмід використовували штам Escherichia coli DH5a, у якого не
відбувається рекомбінація, з генотипом: supE44 DlacU169 (f80 lacZDM15) hsdR17
recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1 [74].
Поживні середовища. У роботі використовували тверді та рідкі поживні
середовища. Всі тверді середовища містили у своєму складі 2% агар. Синтетичні
та напівсинтетичні тверді середовища готувалися на основі YNB (від yeast
nitrogen base) без амінокислот та сульфату амонію (1,7 г/л). Залежно від виду,
середовища також містили:
синтетичні глюкозні середовища – 1% глюкози, а також 0,5% сульфату амонію (75
мM NH4+, середовище YND) чи 25 мM хлорид амонію (25 мМ NH4+, середовище YND),
чи не мали джерела азоту (середовище YND(-N)); для дослідження життєздатності
клітин до глюкозних середовищ додавали 20 мкг/мл флоксину Б як у [75]; для
дослідження токсичності n-алканів у кришку чашки Петрі клали стерильний диск
фільтрувального паперу, змочений 1 мл декану (C10), додекану (C12) чи
гексадекану (C16) як у [72];
синтетичні середовища з алканами містили 25 мM хлорид амонію та n-алкан, що
додавався як описано вище;
напівсинтетичне середовище YEE містило 0,05% дріжджового екстракту, 0,5%
етанолу та 0,2% гідрохлориду етиламіну;
У роботі застосовувались також повноцінні тверді поживні середовища наступного
складу:
середовище LB, що містило 1,5% бакто-пептону, 1% NaCl та 0,5% дріжджового
екстракту; для відбору бактерійних трансформантів за маркерами резистентності
до антибіотиків у середовище додавали:
100 мкг/мл ампіциліну чи
50 мкг/мл канаміцину;
середовище на основі збираного молока SMC [58];
середовище YPD, що містило 1% дріжджового екстракту, 1% пептону та 1% глюкози;
для різних потреб до YPD також додавали:
25, 50 або 200 мкг/мл гігроміцину Б чи
10-20 мкг/мл калькофлуору білого чи
4% етанолу чи
0,2 моль/л MOPS для створення pH 7,0-7,4.
Склад рідких поживних середовищ був наступним: середовища YND та YND(-N)
готувалися як описано вище та використовувались для визначення життєздатності
дріжджів в умовах голодування за джерелом азоту в рідкій культурі як описано у
[35]. Крім них, у роботі застосовувались наступні рідкі синтетичні та
напівсинтетичні середовища, що готувалися на основі 50 мM фосфатного буферу pH
6,8 (PB) та YNB без амінокислот та сульфату амонію:
синтетичні середовища з 1% глюкози:
середовище GA з 25 мM хлоридом амонію та
середовище G(-N) без джерела азоту;
напівсинтетичні середовища, до складу яких входило 0,05% дріжджового екстракту:
середовище YEE з 1% етанолу та 25 мM етиламіном;
середовище YEA з 1% етанолу та 25 мM хлоридом амонію;
середовище YOE з 1% олеату та 25 мM етиламіном;
середовище YOA з 1% олеату та 25 мM хлоридом амонію;
Для приготування олеатних середовищ попередньо готували 20-кратну водну
емульсію олеату з 0,5% Tween 80 за допомогою ультразвуку. Рідкі середовища LB
та YPD готувались як описано вище.
Олігонуклеотиди для полімеразної ланцюгової реакції. Для ампліфікації
фрагментів ДНК за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (PCR) у роботі були
використані наступні праймери (табл. 2.1).
Таблиця 2.1
Праймери, що використовувались у даній роботі
Назва
Послідовність, 5/-3/
Посилання
MTC1
GGCCGCTGTCGGGAACCGCGTTCAGG
Дана робота
Продовж. табл. 2.1
Назва
Послідовність, 5/-3/
Посилання
MTC2
GGCCGCACTGAAGGGCTTTGTGAGAG
Те саме
EYFPstart
GGCCTAGGATGGCCCCGCGGGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC
« »
EYFPstop
TTCTAGAGTCCCGGCCGTTTTACTTGTACAGCTCGTCCATG
« »
POX3-ATG
GATCCGCCTAGGCACAATGATCTCCCCCAACCTCACAGCT
[73]
POX3-STOPbis
GAGGCCCGCGGGGCCTCCTCGTCCAGCACGCAAATGTCGTC
Дана робота
Ada1
CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT
[76]
Ada2
P-ACCTGCCC-NH2
[76]
Ap3
CTAATACGACTCACTATAGGGCTCG
Дана робота
Ap5
CTATAGGGCTCGAGCGGCC
Те саме
Zeta10
GACGGTCCGTTTTGCGTTTAAGCC
« »
Zeta11
CCGAGTGAATGTTGCCTGCCG
« »
Zeta21
CACTACCGAGGTTACTAGAGTTGGG
« »
Zeta22
GGGAAAGCGATACTGCCTCGG
« »
Yl-TRS85-f
GCGGATCCTACAGAGACTATGAAACCG
« »
Yl-TRS85-r
CTGGTACCACTCAGTTTCTACTCTCGG
« »
Pdg3-a
CCCGAACACAAAGCGAGC
« »
Pdg3-b
CCATTCTCTGTCAGTGTTCGC
« »
Pdg3-c1
TTTATCGATCTCTGTCCTTGACGGGCAGTAAACC
« »
Pdg3-c2
GAGGGATCCCATCTCTCTGGAAAACCGTCGCC
« »
Продовж. табл. 2.1
Назва
Послідовність, 5/-3/
Посилання
Pdg3-c3
gtctgatctgtggtctggttctaccaagcactacggcaag
« »
Pdg3-c4
CTTGCCGTAGTGCTTGGTaGAaCCAGACCACAGATCAGAC
« »
Плазміди. У наших дослідженнях використовувались наступні плазміди (табл. 2.2).
Таблиця 2.2
Плазміди, що використовувались у даній роботі
Назва
Посилання на конструювання
JMP5 (рис. 2.1)
[72]
pYEG1 (рис. 2.2А)
[77]
pEYFP
(CLONTECH Laboratories, Inc.)
pYEG1-E
- Київ+380960830922