РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріал досліджень. Для дослідження вікових змін міокарда передсердь і
лівого шлуночка матеріалом служили серця 120 молодих (6-7 міс) і старих (24-27
міс) щурів-самців лінії Wistar.
Таблиця 2.1.1.
Дослідження
№ тварин
Ультраструктурне дослідження вікових змін КМЦ і капілярів передсердь і ЛШ
інтактних щурів
10 молодих
10 старих
Ультрацитохімічне дослідження вікових змін активності ферментів міокарда
передсердь і ЛШ інтактних тварин
ЛФ
5 молодих
5 старих
Г-6-Фаза
5 молодих
5 старих
Са2+-АТФаза
5 молодих
5 старих
5’-нуклеозидаза
5 молодих
5 старих
Ультраструктурне дослідження особливостей реакції КМЦ і капілярів передсердь і
ЛШ на гостру гіпоксію
12 молодих
12 старих
Ультраструктурне дослідження особливостей реакції КМЦ і капілярів передсердь і
ЛШ на введення вазопресину
8 молодих
8 старих
Ультрацитохімічне дослідження вікових змін активності ферментів міокарда
передсердь і ЛШ при введенні вазопресину
ЛФ
5 молодих
5 старих
Г-6-Фаза
5 молодих
5 старих
Загальна кількість досліджених тварин
120
Тварин після тіопентал-натриєвої анестезії (з розрахунку 100 мг/кг)
декапітували. Бралися ділянки стінок правого й лівого передсердь, правого й
лівого вушок передсердь, а також стінки лівого шлуночка (в області сосочкового
м'яза).
2.2. Світлова мікроскопія. Серця молодих і старих щурів фіксували в 10% водному
нейтральному розчині формаліну. Після стандартної проводки й заливання в
парафін виготовляли зрізи товщиною 5 - 6 мкм на ротаційному мікротомі
Мікрон-НМ-325 (Німеччина). Фарбування препаратів здійснювалось за
загальноприйнятими методиками: гематоксилін – еозин, методом ван-Гизона,
методом Романовського-Гімза, методом Гайденгайна.
Також для світлооптичного дослідження й морфометрії вікових змін структури
міокарда передсердь і ЛШ виготовлялись напівтонкі зрізи товщиною 1-2 мкм, які
імпрегнували азотистокислим сріблом по Хоувелу і Блеку в нашій модифікації [57,
114]. Зрізи залишали в метанолі насиченому NaОН, протягом 25-40 хвилин, залежно
від товщини зрізів, після чого проводили по спиртах спадаючої концентрації.
Після чого предметні стекла поміщали на водяну лазню (t - 60 0С), потім на
зрізи капали 2-3 краплі желатинового розчину (0,5 м желатину на 25 мол
бідистильованої води, після додавали 0,25 мол концентрованої мурашиної
кислоти). Через 1-1,5 хвилин капали 2-3 краплі 30 %-го водяного розчину
азотистокислого срібла (3 мг азотистокислого срібла на 10 мл бідистильованої
води). Для запобігання випаровування препарати покривали покривним склом. Після
3-5 хвилин препарати промивали кілька разів у воді й підсушували, після чого
препарат опускали на 1-2 хвилини в ксилолі заключали. Потім досліджували за
допомогою світлового мікроскопа Docuval, Carl Zeiss (Jena) c відеонасадкою.
2.3. Морфометрія на світлооптичному рівні. Зі світлового мікроскопа Docuval
Carl Zeiss (Jena) за допомогою комп'ютерної системи відеозахоплення одержували
зображення досліджуваного об'єкта і вимірювали його морфометричні параметри за
допомогою програми Promorph-Paradise версія 5.07.03 (НВК «Єва», лабораторія
морфології й цитології Інституту геронтології АМН України, Київ). При кожному
вимірі проводилося масштабування за допомогою спеціально існуючої в даній
програмі функції, тобто перед кожним дослідженням препарату з мікроскопа
захоплювалося зображення об'єкта-мікрометра, ціна розподілу якого дорівнює 10
мкм (ОМП ДЕРЖСТАНДАРТ 7513-55). Таким чином, визначалося точність виміру й
розмір об'єктів у крапках (пікселях) і вираховувався відповідний розмір у
мікрометрах.
Здійснювалася морфометрія наступних параметрів: площа КМЦ; «зона секреторних
гранул» (площа, що займають секреторні гранули в навколоядерній зоні КМЦ);
площа сполучної тканини.
2.4. Електронна мікроскопія. Шматочки передсердь (включаючи вушка) і лівого
шлуночка (в області сосочковой м'яза) фіксували в 2,5% розчині глютаральдегіду,
потім дофіксовували в розчині 1 % розчині осмієвої кислоти. Подальше
зневоднювання й заливання в смолу (суміш Епону-812 з Аралдитом) проводили по
загальноприйнятому методі. Виготовленні зрізів проводилося на ультратомі
LKB-III (Швеція) за допомогою скляних ножів, що виготовляють на приладі Knife
Maker 7801B (LKB, Швеція). Ультратонкі зрізи товщиною 50-60 нм фарбували 2%-м
розчином уранілацетату і цитратом свинцю. Ультратонкі зрізи досліджували за
допомогою електронного мікроскопа ПЕМ - 125 КО (Україна, Суми).
2.5. Морфометрія на ультраструктурному рівні. Пластинки (негативи) сканувалися
й оброблялися за допомогою пакета програм для морфометрії Promorph-Paradise
(НВК «Єва», Київ). У кожній досліджуваній групі бралося не менш 20 пластинок із
зображенням КМЦ або капілярів від кожної тварини, у сумі не менш 100 КМЦ у
кожній групі. Проводився морфомертичний аналіз наступних параметрів: площа,
діаметр, фактор форми ядер КМЦ і ендотеліальних клітин капілярів; площа,
діаметр ядерець КМЦ; площа, діаметр і кількість секреторних гранул у
перинуклеарній зоні; площа ядер ендотеліоцитів капілярів; площа базального
шару; периметр люмінальної мембрани; площа ендотелію; площа перикапілярного
простору, фактор форми капілярів.
2.6. Комплексна морфо-функциональна оцінка (КМФО) ступеня виразності
деструктивних і адаптаційних змін в міокарді
Для оцінки виразності деструктивних і адаптаційних процесів, що відбуваються в
передсердях і левому шлуночку при старінні, введенні вазопресину й впливу
гострої гіпоксії у щурів різного віку нами застосовувався метод комплексної
морфо-функціональної оцінки. На підставі результатів якісного
ультраструктур
- Київ+380960830922