РОЗДІЛ 2.
Матеріал та методи досліджень
2.1. Об'єкти досліджень
Об'єктами дослідження в експериментах були рослини родини Brassicaceae:
шостидобові проростки рапсу Brassica rapa L. та п’ятидобові проростки
Arabidopsis thaliana (L.) Heinh (стабільно трасформовані лінії, які експресують
химерні гени GFP–MAP4 та GFP–ABD2).
Матеріал для електронно мікроскопічного дослідження кореневих апексів
проростків Brassica rapа, вирощених за умов мікрогравітації, був переданий Є.Л.
Кордюм, яка отримала його в експерименті «Корені» в межах спільного
українсько–американського експерименту на борту космічного корабля «Колумбія»
під час 87–ої місії (19 листопада – 5 грудня 1997 р). Проростки рапсу, які
росли 6 діб в спеціальних ростових камерах на борту космічного корабля
(рис.2.1), були зафіксовані українським космонавтом–дослідником Л.К. Каденюком
у розчині 2,5% глютаральдегіду на PIPES буфері. Постфіксацію 1% OsO4. та
переведення зразків в епон–аралдітові блоки здійснювалося на Землі за загально
прийнятими методиками.
Стабільно трансформовані лінії трансгенного A. thaliana (GFP–MAP4 та GFP–ABD2),
були надані проф. Д. Волькманом та Ф. Балушкою (Інститут клітинної та
молекулярної ботаніки, університет м. Бонн) в рамках півробітництва у спільному
науковому проекті. Лінія A. thaliana (GFP–MAP4) використовується для
візуалізації МТ in vivo, оскільки MAP4 це структурний білок, зв’язаний з МТ,
який за рахунок експресії GFP, дає флуоресценцію в спектрі 500–600 нм.
Стабільно трансформована лінія A. thaliana (GFP–ABD2), представляє собою
продукт злиття GFP з актин зв’язаним доменом 2 (fABD2) фімбрину A. thaliana
(AtFIM1).
Рис.2.1. Ростова камера з 6–добовими проростками B. rapа на борту космічного
корабля «Колумбія».
2.2. Умови вирощування проростків
Для досліджень цитоскелету насінини B. rapa пророщували при освітленні 12000 лк
(10/14 годин світла/темноти) і температурі 24–25ъ С на 1% агарі з додаванням
1/2 середовища Мурашиге–Скуга (MS) та 1.5 % сахарози. Перед пророщуванням
насінини стерилізували в 15% розчині гіпохлориту натрія протягом 5 хв. і
ретельно промивали стерилізованою дистильованою водою. Щоб запобігти
контамінації чашки Петрі додатково обмотували парафілмом. Маніпуляції з
рослинним матеріалом здійснювали в камерах з ламінарним потоком стерильного
повітря для виключення можливості бактеріального і грибкового зараження.
В контрольному варіанті чашки Петрі з насінням встановлювали вертикально, що
дозволяло кореням проростків рости вздовж поверхні агарового середовища. В
дослідному варіанті чашки Петрі з насінням прикріплювали на вісь
горизонтального кліностату, що обертався зі швидкістю 2 оберти за хвилину. Для
досліджень анатомічної структури та ультраструктури проростки B. rapa
вирощували при освітленні 12000 лк (10/14 годин світла/темноти) і 24–25є С в
цукрових стаканчиках на фільтрувальному папері з додаванням поживного
середовища Хогланда (рис. 2.2).
Рис. 2.2. Трубочки з 6–добовими проростками B. rapa у цукрових стаканчиках. З
лівої сторони в контролі, з правої – в умовах кліностатування.
Поверхню насінин A. thaliana (GFP–MAP4 та GFP–ABD2) стерилізовали 15%
гіпохлоритом натрію і промивали дистильованою водою не менше десяти разів. Далі
насіння поміщали у трубочки, приготовлені із фільтрувального паперу, і додавали
поживне середовище Хогланда [137] , після чого проростки росли в скляних
стаканчиках в стаціонарних умовах або були прикріплені до кліностату.
Кліностатування. Ми використовували горизонтальний кліностат, вісь обертання
якого встановлена під кутом 90є до вертикалі, у зв'язку з чим вектор сили
тяжіння під час всього часу обертання діяв поперек головної осі рослини.
Обертання біологічного об'єкту на горизонтальному кліностаті при певній
швидкості забезпечує постійну дезорієнтацію об'єкту відносно вектора
гравітації, що запобігає сприйняттю гравітаційного стимулу і реалізації
гравітропічної реакції .
Ми застосовували режим два оберти за хв., оскільки доведено, що повільне
кліностатування дає найбільшу подібність структурно–функціональних і
біохімічних змін в об'єктах, вирощених при кліностатування до умов реальної
мікрогравітації. Повільне кліностатування є перевіреним засобом для моделювання
такої важливої характеристики мікрогравітації, як дезорієнтація кліностатованих
рослин відносно гравітаційного вектора. Однак кліностатування не в змозі зняти
скалярні ефекти гравітації, такі як гідростатичний тиск і поверхневий натяг,
тому на сьогоднішній час вважають, що даний метод лише частково відтворює
біологічні ефекти мікрогравітації, які викликані відсутністю спрямованості
гравітаційного.
Обробка оризаліном. В випадку A. thaliana (GFP–MAP4), в залежності від варіанту
досліду, додавали поживне середовище Хогланда, яке містило в своєму складі 5
µM/L оризалін, або поживне середовище Хогланда [137], що містило відповідну
кількість ДМСО, оскільки стоковий розчин оризаліну було приготовлено на ДМСО.
Стоковий розчин 20 mM оризаліну, розчиненого в ДМСО (Sigma, USA) зберігали при
?20°C. Для експериментів готували свіжий розчин 5 µM/L оризаліну в поживному
середовищі Хогланда. Проростки росли 5 днів на кліностаті або в стаціонарних
умовах при температурі 22–230C. В кліностатному і контрольному варіантах
використовували пролонговану обробку оризаліном упродовж всього періоду росту,
коли оризалін входив до складу поживного середовища в якому росли проростки, та
короткотривалі обробки оризаліном безпосередньо під конфокальним мікроскопом.
Для короткотривалих обробок, проростки A. thaliana (GFP–MAP4) вирощували в
у
- Київ+380960830922