РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об'єкт досліджень та умови проведення дослідів
Об'єктом досліджень були клітини еритролейкемії людини лінії К562, отримані з колекції клітинних культур Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАНУ. Клітини культивували за присутності індукторів диференціації та апоптозу, гербіміцину А ("Sigma", США) в концентрації 0,04 мкМ, РМА ("Sigma") в концентрації 0,16 мкМ, кверцетину ("Merck", ФРН) в концентрації 30 мкМ, або без індукторів протягом 72 - 96 год. Для досліджень використовували такі часові інтервали: 3, 6, 12, 24, 48, 72, 96 год культивування клітин після додавання в середовище для культивування індукторів.
2.2. Методи культивування клітин
Клітини К562 культивували в середовищі RPMI 1640 ("Sigma", США), що містило 10 % ембріональної телячої сироватки ("GibcoBRL", Велика Британія), 2 мМ L-глутамін, 50 МО/мл пеніциліну, 50 мкг/мл стрептоміцину ("GibcoBRL"), в зволоженій атмосфері з 5 % СО2 при 370С. Пасажування клітин проводили в співвідношенні 1:2 кожні 2-3 доби. До клітин К562, що знаходились в логарифмічній фазі росту, додавали гербіміцин А, РМА або кверцетин. Для цього необхідну для проведення експерименту кількість клітин висівали в середовище культивування (3,5х105 кл/мл) і інкубували з або без індукторів протягом 72 - 96 год. До контрольних клітин в середовище додавали диметилсульфоксид (ДМСО) до кінцевої концентрації 0,05 %, який використовувався як розчинник для індукторів диференціації і апоптозу. Інтенсивність росту клітинної культури оцінювали, підраховуючи кількість клітин в камері Горяєва. Кількість мертвих клітин визначали після їх фарбування вітальним барвником трипановим синім (кінцева концентрація 0,1 %).
2.3. Цитоморфологічні дослідження клітин лінії К562
Цитоморфологічні дослідження клітин лінії К562 в світловому мікроскопі проводили з метою оцінки ступеня і стадії диференціації, а також апоптичних змін в популяції під впливом використаних агентів. Паралельно у флуоресцентному мікроскопі оцінювали ступінь конденсації хроматину ядер клітин К562, зафарбованих 4',6-диамідино-2-феніліндолом (DAPI), при дії гербіміцину А та кверцетину.
2.3.1. Забарвлення клітин за Романовським-Гімзою
Клітини К562 зафарбовували за методом Романовського-Гімзи [6]. Клітини лінії К562 осаджували 5 хв при 2000 g. Осад клітин ресуспендовували в 5 мкл середовища для культивування, наносили на предметне скло і робили тонкий мазок шліфованим склом. Мазки висушували і фіксували в абсолютному метиловому спирті 3-5 хв. Мазки зафарбовували сумішшю 1 мл азур-еозину і 9 мл 10 мМ фосфатного буферу, рН 6,8 протягом 30 хв. Цитологічні препарати промивали водою, висушували на повітрі і досліджували в імерсійній системі світлового мікроскопа. Внаслідок такого забарвлення мазків цитоплазма клітин зафарбовувалась в світло-синій колір, ядра - в колір від рожевого до інтенсивно-пурпурного та фіолетового. В кожному препараті аналізували не менше 800 - 1000 клітин в декількох полях зору під світловим мікроскопом. За морфологічними критеріями оцінювали ступінь та стадію диференціації клітин-попередників. Також оцінювали експресію цитоархітектурних характеристик апоптозу (конденсацію нуклеоплазми і цитоплазми, утворення мембранних тілець, каріотипну дегенерацію ядра з утворенням апоптичних тілець і загальне зменшення розміру клітини).
Апоптичний індекс обраховували за формулою [13]:
2.3.2. Оцінка морфології ядер клітин К562
На фіксовані і висушені мазки клітин наносили розчин флуоресцентного барвника DAPI в концентрації 10 мкМ. Ступінь конденсації хроматину оцінювали під флуоресцентним мікроскопом Microscope ELIPSE E800 з VFM EPI- Fluorescence Attachment, Japan, фільтр UV-2A DM400. В кожному препараті аналізували 1000 ядер клітин і підраховували % апоптичних клітин. Фотографії отримували за допомогою цифрової фотосистеми Nikon Photomicrogrophic Attachment - Hamamatsu Color Chilled 3CCD Camera з програмним забезпеченням HPD-CPx32, придбаним у Hamamatsu Photonics Deutschland GmbH.
2.4. Бензидинова реакція
Ступінь еритроїдної диференціації клітин К562 визначали за накопиченням гемоглобіну, підраховуючи % бензидин-позитивних клітин [175]. Клітини К562 двічі відмивали від середовища культивування охолодженим забуференим фізіологічним розчином (ЗФР), осад клітин ресуспендовували в 100 мкл ЗФР і додавали рівну кількість реакційної суміші, що містила 0,2 % бензидин гідрохлорид, 0,1 М CH3COOH та 0,15 М пероксиду водню ("Sigma"). Через 10 хв кількість гемоглобін-вмісних клітин підраховували в камері Горяєва.
2.5. Отримання клітинних лізатів
Контрольні та індуковані гербіміцином А, PMA або кверцетином клітини (1x107 кл/пробу) двічі промивали ЗФР і лізували на льодовій бані протягом 20 хв в 0,8 мл буферу лізування, що містив 10 мМ трис-HCl, pH 7,5, 50 мM NaCl, 1 % тритон X-100, 5 мM EДTA, 50 мM NaF, 1 мМ Na3VO4 та інгібітори протеаз, - 1 мМ фенілметансульфонілфторид (PMSF) ("Fluka"), 5 мМ бензамідин, 25 мкг/мл апротиніну ("Sigma"), 10 мкг/мл лейпептину ("Sigma"), 1мкг/мл пепстатину ("Fluka"). Детергент-нерозчинну фракцію осаджували центрифугуванням при 13000 g протягом 15 хв при 4 0С. Отримані супернатанти використовувались для визначення активності ферментів, преципітації з рекомбінантними білками, кон'югованими з глутатіон-S-трансферазою.
Концентрацію білка в лізатах визначали за методом Петерсона [164].
2.6. Експресія і очистка рекомбінантних білків, кон'югованих з GST, в бактерійній системі
Для трансформації E. coli штаму XL1-Blue використовували відповідні pGEX/4T3/p85full та pGEX/4T3/p85SH3 плазмідні вектори, люб'язно надані співробітником Інституту ракових досліджень Людвіга (Лондон) доктором І. Гутом. Трансформацію бактерійних клітин здійснювали за методом Мандела і Хіга [147].
Окрему колонію трансформованих