РОЗДІЛ 2
МАТЕРIАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛIДЖЕНЬ
2.1. Об'єкти дослiджень та матеріали
У роботi використовували наступні штами мікроорганізмів:
Штами H. polymorpha, що використовувались у даній роботі є наведені у Таблиці 2.1. Штами дикого типу генетичної лінії NCYC 495: AS8 (leu10), leu1-1 та AS38 (met6) були люб'язно надані доктором П. Садбері (Шеффілдський університет, Великобританія).
Таблиця 2.1.
Штами H. polymorpha, використані у роботі.
Назва штамуГенотипПосилання*AS8leu10140NCYC495-lleu1-1141AS38met6140ОН15leu1-1 met6NCYC495-aade11140ОН16leu1-1 ade11ОН1gcr1-1 leu10ОН2gcr1-2 leu10ОН3gcr1-3 leu10ОН10gcr1-2 leu1-1ОН12gcr1?::ScLEU2 leu1-1 met6ОН17ade11:PMOX-GFP-PTS1:ScLEU2 leu1-1ОН19PMOX-GFP-PTS1:ScLEU2 leu1-1ОН11gcr1-2:PMOX-GFP-PTS1:ScLEU2 leu1-1ОН18gcr1?::ScLEU2:PMOX-GFP-PTS1:ScLEU2*Посилання подані для штамів, описаних іншими авторами.
Використані у роботі хімічні сполуки, реактиви та ферменти були виробництва фірм "Sigma" (США), "Ferak" (Німеччина), Reanal (Угорщина), "Fermentas" (Литва), "NEB" (США), "Promega" (США), "Difco" (США). Хімічні реактиви вітчизняного виробництва мали кваліфікацію "хч" або "осч".
2.2 Методи досліджень
2.2.1. Умови культивування
Штами H. polymorpha вирощували при 37оС у багатому середовищі YPD (1% дріжджовий екстракт, 2% бактопептон, 1% глюкоза), мінеральному середовищі YNB (0,67% Yeast Nitrogen Base (Difco)), або мінеральному середовищі наступного складу (аналог YNB), у г/л: КH2PO4 - 1; (NH4)2SO4 - 3,5; MgSO4 x 7H2O - 0,5; CaCl2 - 0,1; дрiжджовий екстракт " Difco" 0,5. Для вирощування ауксотрофних штамів на мінеральних середовищах додавали відповідні фактори росту - лейцин, метіонін, аденін в концентрації 40-50 мг/мл. Концентрація джерел вуглецю становила 1% (ваговий або об"ємний), якщо не вказано інакше. Агаризовані середовища містили агар (2%).
Бактерійні штами вирощували при 37оС на середовищі LB [142]. Для селекції плазмідовмісних бактерій використовували ампіцилін у концентрації 100 мг/л. Для ампліфікації плазмід у роботі використовували штам E. coli DH5? (lacZ?M15, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17(rK-, mK+), supE44, relA1, deoR, ?(lacZYA-argF)U169) [116], C600 (thi-1, thr-1, leuB6, lacY1, tonA21, supE44) [142]
Для біохімічних експериментів клiтини дріжджів культивували до середини логарифмiчної фази росту в колбах на качалці при 240 об./хв, якщо не вказано інакше. Біомасу клітин (в одиницях оптичної густини (OD590), або в мг сухої маси клітин на 1 мл культуральної рідини) визначали за оптичним поглинанням розведених суспензій, шляхом їх фотометрування на приладі ФЕК КФК-3 при довжині 540 нм у кюветі шириною 1 см.
Розрахунок концентрації в мг/мл вели за формулою:
Е540 n
С = ????? ,
3.3
де Е540 - оптична густина при 540 нм;
n - розведення суспензії;
3.3 - коефіцієнт перерахунку, визначений при калібруванні гравіметричним методом.
Для довготривалого зберігання клітини дріжджів (вирощені на середовищі YPD) та бактерій (вирощені на середовищі LB) заморожували при -70?С з додаванням до культури стерильного гліцеролу (30% для дріжджів та 15 - 20% для бактерій).
2.2.2. Методи генетичного аналізу
Стандартні методи схрещування та споруляції H. polymorpha використовувались, як описано у [140]. Диплоїдні штами підтримувались на середовищі YPD. Для масової вибірки аскоспор використовували метод обробки етанолом, що забезпечує елімінування вегетативних клітин, але виживання дріжджових спор. Суспензію клітин диплоїдних штамів (OD590 1.5), інкубованих на агаризованому середовищі МЕ (2% мальтекстракт) при 30?С протягом чотирьох діб, інкубували з етанолом (кінцева конкентрація 33%) при 37?С протягом 30 хв. періодично перемішуючи. Після розведення у 100-1000 разів (залежно від ефективності споруляцію конкретного диплоїдного штаму) суспензію висівали на агаризоване багате середовище YPD, або мінеральне середовище з необхідними факторами росту.
2.2.3. Біохімічні методи
2.2.3.1. Пермеабiлiзацiя клiтин
Клітини відмивали від культуральної рідини центрифугуванням при 6 тис. об. хв. та двократним ресуспендуванням у дистильованій воді. Відмиті від середовища клiтини ресуспендували в 100 мМ K, Na-фосфатному буфері, рН 7,5 до концентрації клітин 20-50 мг/мл (у перерахунку на суху масу). До суспензії клітин додавали рівний об'єм водного розчину дигiтонiну або броміду цетилтриметиламонію (2 мг/мл). Сумiш iнкубували на водянiй банi при 300С, перемішуючи кожнi 3-4 хв, протягом 15 хв. Пiсля пермеабiлiзацiї клiтини тричi вiдмивали 5 мМ фосфатним буфером, рН 7,5 i заморожували. Концентрацiю "тiней" (пермеабілізованих клітин) визначали, як описано вище для iнтактних клiтин.
2.2.3.2. Отримання безклiтинних екстрактів
До осаду відмитих від культуральної рідини клітин додавали 50 мМ К,Nа-фосфатний буфер, рН 7,5 з 1 мМ PMSF до кiнцевої концентрацiї клiтин 50-100 мг/мл. Одержану суспензiю переносили у пластикові пробірки "Епендорф" та додавали склянi кульки (дiаметр 0,45-0,5 мм) в кiлькостi 3/4 вiд об'єму суспензiї i заморожували. Клітини руйнували на методом вортексування (вібрації) протягом 15 хв. при +40С з охолодженням на льоді через кожні 5 хв. Для отримання безклітинного екстракту гомогенiзат центрифугували протягом 20 хв при 13000 об./хв при +50С на мікроцентрифузі. Супернатант після додавання додаткової порції PMSF (до 1 мМ концентрацiї ) використовували для подальшого аналізу.
Концентрацію білка визначали за методом Лоурі та співавторами [143], використовуючи бичачий сироватковий альбумін як стандарт.
2.2.3.3. Визначення активностей ферментів
Якісне визначення активності АО в дріжджових колоніях на агаризованому середовищі проводили згідно з протоколом, описаним раніше [144].
Кількісне визначення активності АО проводили або in situ в пермеабілізованих дигітоніном клітинах дріжджів [137], або у безклітинних екстрактах [145].
Питому активність алкогольоксидази визначали за кількістю продукованого перекису водню за 1 хв