РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об’єкт і матеріали дослідження
У роботі використовували мишачу лімфому NK/Ly, отриману із клітинного банку
Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.
Кавецького НАН України, м. Київ. Пухлину підтримували шляхом доочеревинного
перещеплення 0,2-0,3 мл асцитної рідини (20-30 млн клітин) на 7-8 день росту
лімфоми від тварини-пухлиноносія до тварини-реципієнта.
Експериментальні тварини утримували відповідно до нормативів законодавства
України [4], а також рекомендації Національного Інституту Здоров’я США [141].
Інтенсивність росту пухлини контролювали щоденним зважуванням мишей. Кількість
живих клітин в асцитній рідині, яку використовували для інокуляції, була не
менше 98%. Забір лімфомних клітин для досліджень проводили на 7-8 (1-й пасаж),
13-14 (2-й пасаж) та 20-21 (3-й пасаж) дні після інокуляції пухлини. В кінці
експерименту робили розтин тварин і зважували їхні органи. Особливу увагу
приділяли печінці, селезінці, серцю, мозку, а також каркасній вазі (маса тіла
тварини після усунення внутрішніх органів, голови, шкіри, хвоста і лап).
Протипухлинні препарати доксорубіцин (Ebeve, Австрія), вінкристин (Richter,
Німеччина) та дексаметазон («Дарниця», Україна) було придбано у ліцензованих
аптеках. Препарат мегестерол ацетату було люб’язно надано д.б.н. Луциком М.Д.
(Інститут біології клітини НАНУ, м. Львів). Курс хіміотерапії складався з 10
ін’єкцій препарату через день, починаючи з 5-го дня після інокуляції пухлини.
При використанні комбінованих схем хіміотерапії (два і більше препаратів) курс
іншого препарату зміщували на один день відносно першого, щоб звести до
мінімуму ризик алергічної реакції тварин та несумісності препаратів.
2.2. Цитоморфологічні дослідження
Морфологію клітин лімфоми NK/Ly досліджували на мазках, зафарбованих
азур-еозином за Романовським-Гімза [6], нейтральним червоним, або
гематоксиліном Делафільда.
Для фарбування препаратів азур-еозином до мазків додавали 2-2,5 мл
азур-еозинового барвника (0,67% азуру ІІ та 0,56% еозину в гліцерині),
розведеного у забуференому фізіологічному розчині (ЗФР) у співвідношенні 1:25.
Через 15-20 хв. зразки виймали з кювети з барвником, споліскували дистильованою
водою та сушили у вертикальному положенні. Мікроскопування проводили в
імерсійному маслі, незалежно від мікроскопічного збільшення.
Структуру хроматину виявляли за допомогою фарбування мазків клітин нейтральним
червоним. Мазки витримували у 0,5% розчині барвника (Sigma, США) у 1% оцтовій
кислоті протягом 2-3 годин, контролюючи процес фарбування під мікроскопом,
після чого швидко ополіскували їх 1% розчином оцтової кислоти, дистильованою
водою і висушували.
Для виявлення ядер і хроматину також використовували фарбування гематоксиліном,
приготованим за прописом Делафільда [295]. Мазки занурювали вертикально у
розчин барвника і витримували 60-70 хв., після чого ополіскували 0,1% розчином
аміаку і висушували.
Для візуалізації F-актинових філаментів клітини асциту промивали ЗФР, фіксували
15 хв. при кімнатній температурі у 4% розчині параформальдегіду у ЗФР та
пермеабілізували 3 хв. розчином, який містив 0,1% Тriton-X100 у ЗФР. Після
промивання клітин ЗФР протягом 1 год. при кімнатній температурі в темряві мазки
інкубували у розчині, що містив 66 нМ фалоїдину, кон’югованого з флуоресцентним
барвником AlexaFluor 594 (InVitrogen, США), та 1% БСА у ЗФР. Для візуалізації
ядер клітини інкубували протягом 5 хв. у ЗФР, що містив 1 мкг/мл
4,6-диамідино-2-феніліндолу (DAPI) (Sigma). Після промивання ЗФР на предметне
скло з клітинами наносили середовище для тривалого збереження флуоресценції
GelMount (Sigma) та покривне скло. Клітини досліджували за допомогою мікроскопа
NIKON Eclipse E800.
2.3. Визначення здатності асцитної рідини підтримувати ріст пухлинних клітин
Вплив асцитної рідини, отриманої на різних стадіях росту пухлини, на клітини
NK/Ly досліджували шляхом інкубації in vitro клітин початкових стадій росту
(7-8 днів після інокуляції лімфоми) в асцитній рідині, отриманій на ранній (7-8
днів) і термінальній (20-21 день) стадіях росту асциту. До асцитної рідини,
взятої за асептичних умов, додавали феноловий червоний (кінцева концентрація 20
мкг/мл), гентаміцин (50 мкг/мл), глюкозу (5-6 мкМ/мл), доводили рН до 7,2. До
кондиціонованої таким чином рідини вносили лімфомні клітини NK/Ly до
концентрації 0,5-1 млн/мл та інкубували за асептичних умов при 370С протягом 24
годин. Для оцінки ефективності життєдіяльності клітин визначали споживання
глюкози у часових інтервалах 0-6 годин, 6-12 годин і 12-24 години. Концентрацію
глюкози визначали глюкозооксидазним методом [1].
На початку і в кінці інкубації підраховували кількість клітин після їх
фарбування 0,1% розчином три панового синього у гемоцитометричній камері
Горяєва.
2.4 Виділення РНК, реакція зворотної транскрипції та ампліфікація кДНК
2.4.1. Виділення РНК
Виділення сумарної РНК з клітин здійснювали, використовуючи реагент Trizol
(монофазний розчин фенолу та гуанідин ізотіоціанату, Gibco, США) згідно з
рекомендаціями виробника. Клітини промивали охолодженим ЗФР, після чого
лізували, додаючи 1 мл реагенту Trizol на 2 млн клітин. Перед виділенням РНК
зразки зберігали у мікропробірках при -70 °С. До 1 мл лізату додавали 0,2 мл
хлороформу, пробірки струшували та інкубували 2-3 хв. при кімнатній
температурі, після чого центрифугували 15 хв. при 12000 g, 4 °С. Водну фазу
відбирали в нові пробірки й осаджували РНК додаванням рівного об’єму
ізопропанолу та центрифугуванням 15 хв. при 12000 g, 4 °С. Надосадову рідину
видаляли, осад РНК промивали 1 мл 75%
- Київ+380960830922