РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріали дослідження
Сангвінарин, хелеритрин, хелідонін, коптизин очищені з кореневищ чистотілу
(Chelidonium majus L.) д. б. н. Луциком М.Д. та інженером Осипом Ю.Л і люб’язно
надані для роботи. Гомогенність препаратів контролювали за допомогою
тонкошарової хроматографії на силікагельних пластинках "Sulifol" у системі
розчинників хлороформ : метанол : детиламін (9 : 1 : 0,5) та бензол : хлороформ
: метанол : діетиламін (10 : 9 : 1 :1).
Клітини лімфоми миші лінії NK/Ly та лінії клітин лімфом людини CCRF-СЕМ та МТ-4
отримано з музею клітинних культур Інституту експериментальної патології,
онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України (м. Київ).
Антитіла до білка Bcl-2 та до фрагменту білка PARP вироблено компанією
"Santa-Cruz" (США), каспази-8 та каспази-9 – "Beckman Coulter, Inc." (США),
каспази-3 – "Chemicon" (США), цитохрому с – “BD Biosciences Pharmingen” (США),
Bad – "Beckman Coulter, Inc." (США). У роботі були також використані
анти-мишачі та анти-кролячі антитіла IgG, кон’юговані з пероксидазою хрону
(Sigma Chem. Co, США); нітроцелюлозна мембрана (Hybond, США); ДНК із сім’яників
сперми лосося ("Sigma", США); ДНК виділена з клітин лімфоми миші лінії NK/Ly.
2.2. Умови культивування клітин та визначення цитотоксичної дії речовин
Клітини культивували у середовищі RPMI 1640 (Sigma Chem. Co, США) з додаванням
10 % сироватки крові ембріонів великої рогатої худоби (Sigma Chem. Co) в CO2
інкубаторі, з вмістом 5 % вуглекислого газу в атмосфері повітря. Клітини
інкубували у присутності препаратів у 24-лункових пластикових планшетах.
Досліджувані алкалоїди додавали у концентрації 1-20 мкг/мл. Цитотоксичну дію
препаратів визначали за допомогою забарвлення мертвих клітин трипановим синім.
Для визначення життєздатності клітин, до їх суспензії додавали розчин
трипановго синього до кінцевої концентрації барвника 0,1 % і через 5 хв.
визначали, чи здатна клітина накопичувати барвник. Підрахунок кількості клітин
здійснювали у гематоцитометричній камері Горяєва. Концентрацію клітин з
розрахунку на мл визначали, рахуючи кількість клітин у 25 квадратах камери.
Вплив алкалоїдів на цілісність плазматичної мембрани визначали також шляхом
зафарбовування клітин флуоресцентним барвником DAPI. Цей барвник здатний
специфічно проникати у клітини, які мають порушену плазматичну мембарну та
зафарбовувати ДНК. Для визначення цілісності плазматичної мембрани клітин, до
їх суспензії додавали DAPI до кінцевої концентрації 1 мкг/мл і через 5 хв
визначали, чи зафарбовує він ядра клітин.
2.3. Проточна цитофлуориметрія
Клітини інкубували протягом 24 год в середовищі RPMI-1640 з відповідними
концентраціями алкалоїдів. Клітини промивали двічі холодним PBS та
центрифугували протягом 5 хв при 1500 об/хв. Осад клітин ресуспендовували в 50
мкл охолодженого PBS, до якого додавали 450 мкл охолодженого метанолу та
залишали на 1 год при 4 °С. Для визначення розподілу клітин за фазами
клітинного циклу та апоптозу, клітини ресуспендували у гіпотонічному буфері
(0,1 % цитрат натрію, 0,1 % тритон Х-100, 5 мкг/мл пропідіййодиду). РНК-азу А
додавали до кожного зразку у концентрації 250 мкг/мл. Проточну цитофлуориметрію
проводили на автоматизованій системі (Becton Dickinson, USA). Дані та
аналізували з використанням програми ModFit LT 2.0.
2.4. Отримання лізатів клітин для електрофорезу білків
Для приготування лізатів клітини промивали двічі 1х PBS та центрифугували при
1,5 тис. об/хв. До клітин додавали лізуючий буфер (20 мМ трис-HCl, 1 % тритон
Х-100, 150 мМ NaCl, 1 мМ PMSF, pH 7,6) з розрахунку 100 мкл буферу на 1 млн
клітин та ставили в холодильник на 30 хв при 4 °С. Лізат центрифугували при 12
тис. об/хв. протягом 15 хв та відбирали надосадову рідину у нову пробірку типу
Еппендорф. 40 мкл лізату відбирали на вимірювання концентрації білка за
Петерсеном [144].
До лізату клітин додавали буфер Леммлі (2 % додецилсульфату натрію, 280 мМ
b-меркаптоетанол, 10 % сахароза, 50 мМ трис-HCl рН 6,8, декілька кристалів
бромфенолового синього), розмішували та прогрівали на киплячій водяній бані
протягом 5 хв. Отриманий лізат, готовий для електрофорезу, зберігали у
замороженому стані при –20 °С.
Приготування цитозольної фракції на визначення цитохрому с.
Клітини після інкубації двічі промивали холодним PBS і відцентрифуговували при
2 тис об/хв. протягом 5 хв. До осаду додавали екстракційний буфер (220 мМ
манітол, 68 мМ сахароза, 50 мМ KCl, 5 мМ EGTA, 2 мМ MgCl2, 1 мМ дітіотреїтол та
інгібітори протеаз), з розрахунку 70 мкл буферу на 1 млн клітин і залишали на
30 хвилин при +4 °С. Клітини гомогенізували, пропускаючи суспензію клітин через
інсуліновий шприц (15 рухів). Гомогенат відцентрифуговували при 12 тис об/хв.
протягом 15 хв. при 4 °С. Супернатан відбирали і використовували як цитозольну
фракцію. 30 мкг цитоплазматичного білка розділяли у 12 % SDS-поліакриламідному
гелі і переносили на нітроцелюлозну мембрану. Цитохром с визначали з
використанням моноклональних антитіл (7Н8.2С12; BD PharMingen, США).
2.5. Визначення концентрації білка
Концентрацію білка визначали за Петерсоном [144]. Для цього використовували
реактиви: 10 % додецилсульфат натрію; 0,8 н NaOH; CTC : 0,1 % CuSO4 Ч5 H2O; 0,2
% цитрат натрію; 10 % Na2CO3.
Реактив А: 1 об’єм води : 1 об’єм СТС : 1 об’єм 10 % додецил сульфату натрію :
1 об’єм 0,8 М гідроксиду натрію. Реактив Б: 2 об’єми води : 1 об’єм реактиву
Фоліна (Simko Ltd, Україна)
Для побудови калібрувальної кривої використовували стандартні розчини бичачого
сироваткового альбуміну (Sigma Chem. Co, США), які готували в концентраціях 10,
20, 40, 60, 80, 100 мкг/мл. Концентра
- Київ+380960830922