РОЗДІЛ 2
МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об'єкт дослідження
Мишей із відсутнім геном pttg було отримано із науково-дослідного інституту при Медичному центрі Синайський кедр (Лос-Анджелес, США) у рамках угоди про науково-технічну співпрацю. Дефіцит гену pttg було одержано у мишей лінії BL6/C57 шляхом заміни частини гену pttg (частини 1 екзону, і повністю 2-ий та 3-ій екзони) на ген резистентності до неоміцину у ембріональних, лінії стовбурових J1 клітинах миші, отримали стабільно трансфіковані клони цих клітин, які було введено мікроін'єкцією у бластоцист мишей. Химерних мишей схрещували із мишами лінії BL6/C57, отримуючи у результаті гетерозиготне (pttg +/-) не химерне потомство у розщепленні 1:2. При схрещуванні гетерозиготних особин (pttg +/-) було отримано гомозиготних особин (pttg +/+ та pttg -/-) у розщепленні 1:2:1, генотип котрих визначали методом поліперазної ланцюгової реакції із використанням специфічних генних праймерів. Із гомозиготних особин виділяли спленоцити із яких, у свою чергу, імунномагнітним методом виділяли фракцію Т-лімфоцитів, на яких проводили дослідження.
2.2. Схрещування мишей
Миші із відсутнім геном pttg (pttg -/-) є життєздатними, хоча і володіють обмеженою фертильністю. Тому для забезпечення чистоти експерименту і для забезпечення близькоспорідненості особин дикого типу (pttg +/+) та особин із відсутнім геном pttg (pttg -/-), їх отримували шляхом схрещування двох гетерозиготних особин (двох pttg +/- особин). При такому схрещуванні отримували нормальну кількість потомства (6-10 мишенят), у якому із генетичним розщепленням 1:2:1 були мишенята із генотипами 1 pttg -/-: 2 pttg +/- : 1 pttg +/+. У віці 6-7 тижнів малят розсаджували за статтю та визначали їх генотим методом полімеразної ланцюгової реакції.
2.3. Визначення генотипу мишей
У мишей віком 6-7 тижнів відбирали із хвоста 100-150 мкл крові у стерильну пробірку типу Eppendorf. Як антикоагулянт використовували ЕДТА із розрахунку 20 мкл 0,5М ЕДТА на 100-300 мкл крові. Кров заморожували при
-20?С. Після цього кров розморожували +4-6?С та швидко перемішували, уникаючи формування згустків не лізованих клітин, які можуть утворитися у подальшому при додаванні лізувального буферу до не перемішаного зразка крові.
2.3.1. Виділення ДНК. Для виділення ДНК із зразків крові мишей, використовували реактиви фірми "IsoGene" (Москва, Росія). Оскільки гени pttg людини та миші володіють високим ступенем ідентичності, для уникнення контамінації проб крові мишей людською ДНК дослідника та отримання у подальшому псевдо-позитивного виявлення присутності гену pttg дикого типу, посуд перед використанням стерилізували, роботу проводили в стерильних рукавичках та масці, а забір крові, виділення ДНК та змішування реактивів для проведення полімеразної ланцюгової реакції проводили у різних кімнатах.
До розмороженого, та ретельно, але швидко перемішаного, зразка крові додавали лізувальний буфер із розрахунку 300 мкл цього буферу на 100 мкл крові (без ЕДТА). Після додавання лізувального буферу, пробу ретельно перемішували до зникнення згустків клітин, але намагалися уникати механічного пошкодження ДНК. Для забезпечення повного лізування клітин, лізати витримували при +?65С протягом 5 хв. Після цього проби центрифугували при 8 000 обертів на хвилину (об/хв) протягом 30 сек (4°С), надосадову рідину відбирали у чисту пробірку, до останньої додавали 20 мкл суспензії сорбенту NucleoSтм (сорбенту на основі силіки) та перемішували протягом 5 хв. Після цього проводили центрифугування при 8 000 об/хв протягом 30 сек, надосадову рідину видаляли, а до осаду додавали 300 мкл лізувального буферу для того, щоб відмити сорбент із ДНК від залишків лізату, перемішували до гомогенного стану та центрифугували при 8 000 об/хв протягом 30 сек. Надосадову рідину видаляли а до осаду додавали 1 мл етанол-вмісного сольового буферу, перемішували та центрифугували 8 000 об/хв протягом 30 секунд. Надосадову рідину обережно видаляли, а до осаду знову додати 1 мл етанол-вмісного сольового буферу, перемішували до гомогенного стану та центрифугували при 10 000 - 11 000 об/хв протягом 40 сек, надосадову рідину видаляли, а осад сушили при температурі 37°С протягом 3-5 хв до повного висихання осаду. До осаду додавали екстрагуючого реагенту (ЕкстраГентм) із розрахунку 100 мкл реагенту на кожні 100 мкл крові, але не менше ніж, 150 мкл реагенту. Вміст пробірок перемішували протягом 5-15 сек до гомогенного стану та інкубували протягом 5 хв при 65°С. Суспензію центрифугували при 12 000 об/хв протягом 5 хв і надосадову рідину (розчин ДНК) переносили в нові пробірки і використовували для ідентифікації методом полімеразної ланцюгової реакції гену pttg або вставки інвертованої замість цього гену у нокаутних мишей.
2.3.2. Полімеразна ланцюгова реакція. Ідентифікацію гену pttg або вставки інвертованої замість цього гену у нокаутних мишей, проводили за допомогою полімеразної ланцюгової реакції із використанням праймерів, специфічних до гену pttg або вставки (Таблиця 2.1).
Полімеразну ланцюгову реакцію проводили із використанням реактивів від фірми Fermentas (Вільнюс, Литовська Республіка). В стерильну пробірку на льоді вносили 13,1 мкл стерильної деіонізованої води, 3 мкл 10Х буферу для полімеразної ланцюгової реакції (із KCl і без (NH3)2SO4 ), 1,8 мкл MgCl2, 3 мкл 2 мМ суміші (до кінцевої концентрації 0,2 мМ) dNTP, по 2,7 мкл Forward та Reverse праймерів (до кінцевої концентрації 0,5 пікаМ кожного праймера), та 0,15 мкл Taq-полімерази (5 одиниць/мл) або TAKARA-полімерази (5 одиниць/мл). Суміш обережно перемішували та додавали 7,2 мкл ДНК виділеної із клітин крові піддослідних мишей. Суміш знову обережно перемішували та відцентрифуговували 30 сек при 80-120 g.
Полімеразну ланцюгову реакцію проводили за оптимізованою нами раніше програмою (Таблиця 2.2), провівши попередньо денатурацію геномної ДНК миші у реакційній суміші при 94?С протягом 6 хв.
Таблиця 2.1
Праймери для ідентифіка