РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали досліджень
У роботі використані хімічні сполуки, реактиви та ферменти виробництва фірм: "Sigma" (США), "Fluka" (Німеччина), "Reanal" (Угорщина) "Fermentas" (Литва), "NEB" (США), "Promega" (США), "Difco" (США). Кваліфікація хімічних реактивів вітчизняного виробництва - "хч" та "осч".
2.2. Штами мікроорганізмів
Штами пекарських дріжджів Saccharomyces cerevisiae, метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha, та бактерій Escherichia coli, що використовувались у даній роботі, представлені у таблиці 2.1.
Таблиця 2.1.
Штами мікроорганізмів, використані в роботі
Назва штамуГенотипПосилання*H. polymorphaNCYC 495leu1-1[263]ОН12gcr1::ScLEU2 leu1-1 met6[7]ОН19PMOX-GFP-PTS1:ScLEU2 leu1-1[7]ОН18gcr1::ScLEU2:PMOX-GFP-PTS1:ScLEU2[7]?gcr1met6gcr1::ScLEU2 leu1-1[7]?hxs1hxs1::ScLEU2 leu1-1?gcr1?hxs1gcr1::ScLEU2 hxs1::ScLEU2 leu1-1?hxt1hxt1::ScLEU2 leu1-1?mig1mig1::HpLEU2 leu1-1?mig1leu1-1mig1::PGAP-APH leu1-1?mig2mig2::ScLEU2 leu1-1
Продовж. табл. 2.1.
?mig1?mig2mig1::PGAP-APH mig2::ScLEU2 leu1-1?tup1leu1-1tup1::HpURA3 leu1-1[101]S. cerevisiaeVW1AMAT? leu2-3, 112 ura3-52 trp1-289 his3?1 MAL2-8C SUC2[52]EBY.VW4000leu2-3, 112 ura3-52 trp1-289 his3?1 MAL2-8C SUC2 hxt17? hxt13? hxt15? hxt16? hxt14? hxt12? hxt9? hxt11? hxt10? hxt8? hxt514? hxt2? hxt367? gal2??slt1??agt1 ?ydl247 ?yjr160c?[52]E. coliDH5?lacZ?M15, recA1, endA1, gyrA96,
thi-1, hsdR17(rK-, mK+), supE44, relA1, deoR, ?(lacZYA-argF)U169
[187]
*Посилання подані для штамів, описаних іншими авторами.
2.3. Плазміди
Перелік плазмід, що використовувались у даній роботі, та посилання на схеми конструювання цих векторів представлено у таблиці 2.2.
Таблиця 2.2.
Перелік векторів, використаних у даній дисертаційній роботі
НазваПосилання на конструюванняpOH1 (Рис. 3.35)Пункт 3.4. даної дисертаційної роботи
pYT1
[228]pGLG578[5]
pPICZBInvitrogenTM, Cat. No V 19020
pOS22[7]pBM2974[174]
Продовж. табл. 2.2.
p19-mig12::HpLEU2 (Рис. 2.3)[доктор Х.А. Канг, неопубліковані дані ]pOH7 (Рис. 2.3)Пункт 2.6.10 даної дисертаційної роботи
pOH8 (Рис. 2.3)Те самеpOH11 (Рис. 2.1)Пункт 2.6.8 даної дисертаційної роботиpOH12 (Рис. 3.19 А)Пункт 3.3.2. даної дисертаційної роботиpOH13 (Рис. 3.19 Б)Те самеpOH14 (Рис. 2.2)Пункт 2.6.9 даної дисертаційної роботиpOH15 (Рис. 3.16 А)Пункт 3.3.1. даної дисертаційної роботиpOH16 (Рис. 3.16 Б)Те самеpOH17 (Рис. 3.22 А)Пункт 3.3.3. даної дисертаційної роботиpOH18Те самерОН19-//-
2.4. Поживні середовища
Штами H. polymorpha вирощували при 37оС у багатому середовищі YPD (1% дріжджовий екстракт, 2% бактопептон, 1% глюкоза), YPS (1% дріжджовий екстракт, 2% бактопептон, 1% сахароза), YPЕ (1% дріжджовий екстракт, 2% бактопептон, 1% етанол), мінеральному середовищі YNB (0,67% Yeast Nitrogen Base (Difco)), або мінеральному середовищі наступного складу (аналог YNB), у г/л: КH2PO4 - 1; (NH4)2SO4 - 3,5; MgSO4 x 7H2O - 0,5; CaCl2 - 0,1; дрiжджовий екстракт "Difco" - 0,5. Для вирощування ауксотрофних штамів на мінеральних середовищах додавали відповідні фактори росту - лейцин, метіонін, аденін в концентрації 40-50 мг/мл. Концентрація джерел вуглецю становила 1% (масовий або об'ємний), якщо не вказано інакше. Агаризовані середовища містили агар (2%).
Для біохімічних експериментів дріжджі культивували до середини логарифмiчної фази росту в колбах на качалці при 220 об./хв, якщо не вказано інакше. Біомасу клітин (в одиницях оптичної густини (OD600) визначали за оптичним поглинанням розведених суспензій шляхом фотометрування на спектрофотометрі "Helios-?" при довжині 600 нм у кюветі шириною 1 см.
Бактерійні штами вирощували при 37оС на середовищі LB [205]. Для селекції плазмідовмісних бактерій додавали ампіцилін у концентрації 100 мг/л.
2.5. Біохімічні методи
2.5.1. Отримання безклiтинних екстрактів. Безклітинні екстракти отримували двома способами: 1) з використанням скляних кульок "балотіні" [1], та 2) екстракцією білків трихлороцтовою кислотою (ТХО) [101].
Для приготування безклітинних екстрактів з використанням "балотіні" до осаду відмитих від культуральної рідини клітин додавали 50 мМ К-фосфатний буфер, рН 7,5 з 1 мМ PMSF (фенілметансульфонілфторид) до кiнцевої концентрацiї клiтин 50-100 мг/мл. Одержану суспензiю переносили у пластикові пробірки "Епендорф" та додавали склянi кульки (дiаметр 0,45-0,5 мм) в кiлькостi 3/4 вiд об'єму суспензiї i заморожували. Клітини руйнували на методом вібрації протягом 15 хв при +4оС з охолодженням на льоді через кожні 5 хв Для отримання безклітинного екстракту гомогенiзат центрифугували протягом 20 хв при 14000 об./хв при +4оС на мікроцентрифузі. Супернатант після додавання додаткової порції PMSF (до 1 мМ концентрацiї) використовували для подальшого аналізу.
Концентрацію білка визначали за методом Лоурі та співавторами [184], використовуючи бичачий сироватковий альбумін як стандарт.
Для приготування безклітинних екстрактів з використанням ТХО до осаду відмитих від культуральної рідини клітин додавали 0,4 мл 12,5% трихлороцтової кислоти. Отриману суспензію клітин витримували не менше
2 год при -70оС і осаджували центрифугуванням протягом 3 хв при 14000 об./хв Осад двічі промивали 0,5 мл 80% розчину ацетону, підсушували при кімнатній температурі і ресуспендували в 0,1мл лізуючого буферу (1% SDS+0,1 M NaOH). До одержаного лізату додавали рівний об'єм двократного буферу Леммлі (62,5 мМ Тріс-HCl, pH 6,8, 1 мМ ЕДТА, 2% SDS, 5% ?-меркаптоетанол, 10% гліцерин, 0,4% бромфеноловий синій).
2.5.2. Визначення активностей ферментів. Якісне визначення активності АО в дріжджових колоніях на агаризованому середовищі проводили згідно з протоколом, описаним раніше [3].
Кількісне визначення активності АО проводили або in situ в пермеабілізованих дигітоніном клітинах дріжджів, або у безклітинних екстрактах [1].
Питому активніст