РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
2.1. Обґрунтування вибору тестової системи
Найбільшу небезпеку для біоти мають процеси, в яких утворюються продукти, здатні проявляти віддалені ефекти, зокрема ті, що володіють мутагенною та канцерогенною активністю. Тому, з огляду на зростання масштабів хімічного забруднення довкілля, постає необхідність організації та проведення біомоніторингу - постійних спостережень та оцінки екологічного стану навколишнього середовища і прогнозування біологічного ризику полютантів. З цією метою ведеться пошук найчутливіших до токсичних речовин та мутагенів видів рослин, тварин і мікроорганізмів [Перерва и др., 1998, Макарчук, 2000], а також молекулярних, надмолекулярних та клітинних біомоделей [Луйк и др., 1999] як ефективних індикаційних систем забруднення довкілля.
Мутагенний та цитотоксичний потенціал важких металів проявляється по-різному в тест-системах відмінної біологічної природи. Порівняння даних з визначення мутагенності солей важких металів для про- та еукаріот показує особливо суттєву різницю між рівнем пошкоджуючої дії цих сполук для організмів з різною організацією спадкового матеріалу. Так у мікроорганізменних та вірусних тест-системах ряд металів (свинець, нікель, хром) не виявляють мутагенної активності [Мацевич, Лукаш, 2001], тоді як для еукаріотичних індикаційних систем переважають позитивні результати.
Серед широкого спектру модельних еукаріотичних організмів для скринінгу мутагенів тільки рослини можуть метаболізувати деякі хімічні речовини до генотоксичних похідних [Сьяксте, Сьяксте, 1991]. Таким чином, рослинні тестові системи здатні виявляти навіть промутагени, що дуже важливо для прогнозування віддалених біологічних наслідків дії окремих полютантів. Так, на думку деяких вчених, прості рослинні тести in vitro надійніше виявляють ініціаторів канцерогенезу, ніж тривалі тести з лабораторними тваринами [Ennever et al., 1988; Ehrenberg, 1989].
2.2. Характеристика об'єкту
Серед рослинних індикаційних систем біологічно-небезпечних речовин важливе місце належить Allium тесту, який забезпечує швидку процедуру скринінгу цих компонентів [Fiskesjo, 1995]. Відомо, що коренева система цибулі (Allium cepa L.) є особливо чутливою до шкідливих впливів полютантів ґрунту. Крім того, великі розміри клітин, чітка морфологія хромосом та відносно невелика їхня кількість (n=8) робить цей об'єкт ідеальним для цитологічних досліджень [Grant, 1982; Довгалюк та ін., 1998]. Пригнічення росту коренів цибулин та несприятливі ефекти на хромосоми, виявлені в меристемних клітинах кореневого апексу, вказують на потенційну токсичність і мутагенність тестованих сполук. Між макроскопічними та мікроскопічними ефектами, що можуть бути виявлені в даній тестовій системі, спостерігається чітка кореляція. Однак пригнічення росту коренів (макроскопічний ефект) є чутливішим параметром. Мікроскопічний же аналіз дозволяє оцінити хромосомні пошкодження та порушення клітинного поділу, забезпечуючи додаткову інформацію щодо ступеню чи механізму токсичного ефекту, чи потенційної мутагенності досліджуваної речовини. Деякі ферменти кореневих клітин цибулі, оксидази змішаних функцій, здатні активувати промутагени в мутагени. Тому Allium тест може виявляти навіть такі потенційно біонебезпечні речовини, що проявляють свій генотоксичний ефект опосередковано, через утворення реактивних метаболітів [Fiskesjo, 1995].
В Allium тесті позитивні результати на токсичність можуть давати чимало сполук, які не виявляються шкідливими під час тестування на інших модельних об'єктах, тому він по праву належить до високочутливих індикаційних систем [Fiskesjo, 1995]. Окрім того, відмічено, що для Allium тесту та інших подібних рослинних тестів не характерні негативні артефакти: тестовані речовини, які дають негативні результати при такому скринінгу, можуть надійно вважатись немутагенними [Ennever et al., 1988].
Allium тест ефективно працює в широкому діапазоні рН значень тестових розчинів (3,5-11,0) без будь-яких очевидних ефектів на ріст кореневої системи. Таким чином, помірно кислі/лужні водні зразки, хімічні розчини, тощо можуть бути просто тестовані без необхідної рН корекції [Fiskesjo, 1995].
У класичному Allium тесті досліди пропонується проводити на додаткових коренях цибулин, так як вони здебільшого одного розміру і віку, що зручно для статистики [Wierzbicka & Antosiewicz, 1988; Fiskesjo, 1995]. Однак для наших досліджень було вибрано зручніший модельний об'єкт - корінці 3-4-денних проростків Allium cepa L. Такий вибір зумовлювався тим, що проростки чутливіші до полютантів ґрунту, ніж дорослі рослини [Титов и др., 2001; Malkowski et al., 2002]. Крім того, модифікація Allium тесту надавала йому ще однієї переваги: поділи клітин в апікальній меристемі коренів на ювенільній стадії розвитку рослин більш синхронізовані та інтенсивні, а клітинна стінка ще ніжна і легко руйнується, що полегшувало дослідження внутрішньоклітинних структур на давлених препаратах.
2.3. Характеристика реактивів, використаних у роботі
У роботі використано реактиви фірм:
1. "Aldrich" (США): піперазино-N,N`-біс[2-етансульфонова кислота] (PIPES).
2. "Calbiochem" (Швейцарія): лейпептин, пепстатин А, трітон Х-100.
3. "Fluka" (Швейцарія): параформальдегід (ПФА).
4. "Serva" (Германія): целюлаза онозука R-10, Na2HPO4, NaH2PO4, MgSO4x7H2O.
5. "Sigma" (США): мацерозим R-10, дріцелаза, апротинін, етиленгліколь-біс[?-аміноетил]-N,N,N?N?-тетраоцтова кислота (EGTA), бичачий сироватковий альбумін (БСА), полі-L-лізин (молекулярна вага 50000 - 100000), первинні моноклональні антитіла миші до ?-тубуліну, вторинні антимишачі антитіла, кон?юговані з ФІТЦ.
Усі інші використані реактиви були вироблені в країнах СНД і мали кваліфікацію ч.д.а. або о.с.ч.
2.4. Умови пророщування насіння
Насіння цибулі сорту Донецька золотиста пророщували в термостаті у скляних чашках Петрі на фільтрувальному папері, зволоженому дистильованою водою, в темряві при температурі 25?C. Для дослідів в